基于細(xì)胞自噬探討參附配伍減毒的作用機(jī)制.pdf

1、中藥方劑是幾千年來中國人民用以抵抗疾病的一套奇特的藥物系統(tǒng)。方劑配伍優(yōu)點(diǎn)明顯，它能夠增強(qiáng)藥物療效、減低藥物毒性、擴(kuò)大藥物治療范圍等。然而方劑也因其組成復(fù)雜，有效成分多樣，導(dǎo)致其藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)不清晰，作用機(jī)制、配伍規(guī)律不明確，成為中藥現(xiàn)代化的一個(gè)重要阻力。因此探索中藥方劑的物質(zhì)基礎(chǔ)、配伍規(guī)律、作用機(jī)制已成為中藥現(xiàn)代化研究的新熱點(diǎn)。本課題組前期以參附方為代表，從化學(xué)、藥代、藥效、毒理等方面對(duì)中藥配伍減毒增效機(jī)制進(jìn)行了較系統(tǒng)的探索，但是在藥

2、理機(jī)制方面研究較少。本課題則進(jìn)一步在藥理機(jī)制層面，從細(xì)胞自噬角度探討參附配伍減毒增效的作用機(jī)制，以期完善對(duì)參附配伍減毒增效規(guī)律的認(rèn)識(shí)，拓展中藥配伍減毒增效機(jī)制的研究思路。
　　本文首先以阿霉素建立心肌細(xì)胞自噬損傷模型。采用CCK-8、透射電鏡、熒光染色、Western blot等方法分別檢測阿霉素作用于H9c2細(xì)胞后，心肌細(xì)胞的增殖以及自噬變化。結(jié)果顯示，阿霉素能顯著引起 H9c2細(xì)胞活力下降，并導(dǎo)致H9c2細(xì)胞的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增加

3、，與此同時(shí)自噬標(biāo)志性蛋白LC3B由LC3B-I轉(zhuǎn)變?yōu)長C3B-II的量增加及p62蛋白表達(dá)降低。以上結(jié)果證明了阿霉素可以引發(fā)心肌細(xì)胞自噬性損傷。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了建立細(xì)胞自噬損傷模型的方法是1μmol·L-1阿霉素處理細(xì)胞12 h。
　　其次，通過人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re預(yù)處理H9c2細(xì)胞6 h，然后與5μmol·L-1阿霉素共處理24 h后檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1可顯著抑制阿霉素引

4、起的心肌細(xì)胞活力下降而人參皂苷Re的抑制效果則不明顯。采用熒光染色和Western blot方法分別檢測阿霉素和人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1聯(lián)用后對(duì)H9c2細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1均能抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增加、LC3B-I轉(zhuǎn)變?yōu)長C3B-II的增加以及p62蛋白表達(dá)的降低。以上結(jié)果提示，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用，這種作用可能是通過調(diào)節(jié)自噬產(chǎn)生的。

5、　　再次，應(yīng)用Western blot法分別檢測了烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿作用于H9c2細(xì)胞后，心肌細(xì)胞自噬的變化。結(jié)果顯示，隨著烏頭堿、次烏頭堿濃度的升高以及給藥時(shí)間的延長，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ先升高后降低，同時(shí)與對(duì)照組相比，p62蛋白表達(dá)變化不明顯。提示烏頭堿、次烏頭堿可以誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞自噬。而中烏頭堿不同濃度處理細(xì)胞12 h后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ無明顯變化，但LC3B-Ⅱ升高、p62蛋白則出現(xiàn)升高趨勢。10μm

6、ol·L-1中烏頭堿不同時(shí)間處理細(xì)胞后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ、p62均出現(xiàn)升高趨勢。以上結(jié)果提示，中烏頭堿可能阻斷了H9c2心肌細(xì)胞自噬。
　　最后，應(yīng)用透射電鏡、熒光染色、Western blot等多種方法檢測了烏頭堿對(duì)大鼠原代心肌細(xì)胞自噬的影響。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予烏頭堿后在透射電鏡下可明顯觀察到細(xì)胞中的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)；熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予烏頭堿后細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng)且成斑點(diǎn)狀出現(xiàn)在細(xì)胞中；Weste

7、rn blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，給予烏頭堿后細(xì)胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ升高且p62蛋白表達(dá)降低。以上結(jié)果再次證明烏頭堿可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬活化。將人參皂苷Rg1與烏頭堿共孵育于原代心肌細(xì)胞12 h后，觀察原代心肌細(xì)胞自噬變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，烏頭堿組細(xì)胞綠色熒光明顯增強(qiáng)且成斑點(diǎn)狀出現(xiàn)在細(xì)胞中，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ明顯升高，而人參皂苷Rg1與烏頭堿共處理組綠色熒光較烏頭堿組則明顯減弱且大部分呈彌散狀分布于細(xì)胞

8、中，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ也小于烏頭堿組。以上結(jié)果提示，人參皂苷Rg1可以抑制烏頭堿誘導(dǎo)的原代心肌細(xì)胞自噬活化。
　　綜上所述，本文證明了人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對(duì)阿霉素引起的心肌細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用，這種保護(hù)作用與抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬活化有關(guān)；烏頭堿、次烏頭堿、中烏頭堿可以擾亂心肌細(xì)胞正常的自噬狀態(tài)，其中烏頭堿、次烏頭堿可以誘導(dǎo)自噬，而中烏頭堿則可以阻斷自噬；人參皂苷Rg1可以抑制烏頭堿引起的大鼠原代心肌細(xì)胞自噬活化。