牛黃解毒片的遺傳毒性研究及其方藥配伍減毒作用初探.pdf

1、牛黃解毒片是中醫(yī)臨床清熱解毒的經(jīng)典方劑，用于治療火熱內(nèi)盛，咽喉腫痛，牙齦腫痛，口舌生瘡及目赤腫痛等癥。為評價牛黃解毒片的安全性，本研究采用Ames試驗、染色體畸變分析、單細(xì)胞凝膠電泳試驗(SCGE)、微核試驗等方法，探討了牛黃解毒片在體內(nèi)、外實驗條件下，有無潛在的遺傳毒性作用；此外，配伍是最具中醫(yī)特色的減毒方法和技術(shù)之一，為探討牛黃解毒片配伍對雄黃是否具有減毒作用，本研究在已有研究基礎(chǔ)上，設(shè)立牛黃解毒片全方及其不同拆方組，通過可溶性砷鹽

2、含量、砷在機(jī)體組織的分布、病理損傷、氧化損傷、遺傳損傷、細(xì)胞凋亡等指標(biāo)的檢測，擬初步探討牛黃解毒片方藥配伍對雄黃有無減毒作用及其可能機(jī)制。
　　 1.牛黃解毒片的遺傳毒性研究
　　 1.1.牛黃解毒片遺傳毒性的體外實驗研究
　　 1.1.1.牛黃解毒片對鼠傷寒沙門氏菌菌株的回復(fù)突變作用采用平皿摻入法，按照Maron DM和Ames BN推薦程序，根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，以5mg.皿-1為最高劑量，下設(shè)1.5、0.5、0.

3、15、0.05mg.皿-1四個劑量組和陰、陽性對照組開展實驗。結(jié)果表明，牛黃解毒片水溶液在試驗劑量為0.05mg.皿-1至5mg.皿-1，在加與不加S9混合液兩種情況下，各劑量組和陰性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，且各菌株的回復(fù)菌落數(shù)均未超過陰性對照組2倍，也未呈現(xiàn)一定劑量-反應(yīng)關(guān)系。
　　 1.1.2.牛黃解毒片對CHL細(xì)胞的染色體畸變作用采用細(xì)胞計數(shù)法測出牛黃解毒片水溶液對CHL細(xì)胞的半數(shù)生長抑制濃度(IC50)約為54μ

4、g.ml-1，以此濃度為高劑量組，采用倍比稀釋法，設(shè)立中、低劑量組（分別為27和13.5μg.ml-1）進(jìn)行染色體畸變實驗。結(jié)果表明，牛黃解毒片在接觸24h時和在加入活化系統(tǒng)S9接觸6h時，高、中、低三個劑量組的染色體畸變率均小于5％，為陰性反應(yīng)；而牛黃解毒片在接觸48h時，中劑量組的畸變率為8.5%，大于5%為可疑陽性反應(yīng)，高、低二個劑量組畸變率小于5%，為陰性反應(yīng)。
　　 1.1.3.牛黃解毒片對CHL細(xì)胞的DNA損傷作用應(yīng)

5、用單細(xì)胞凝膠電泳實驗(SCGE)檢測了牛黃解毒片對CHL細(xì)胞DNA鏈的斷裂作用，結(jié)果顯示，CHL細(xì)胞接觸牛黃解毒片水溶液48h后，中、低劑量組與陰性對照組比較，差異無顯著性；而高劑量組與陰性對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，表明本實驗條件下，牛黃解毒片水溶液高濃度時會引起體外培養(yǎng)CHL細(xì)胞DNA的損傷。
　　 1.2.牛黃解毒片遺傳毒性的整體動物實驗研究
　　 1.2.1.牛黃解毒片對小鼠體細(xì)胞染色體完整性與分離

6、改變的影響采用經(jīng)口給藥，進(jìn)行小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗。設(shè)立三個劑量組(3345、1670、835mg.kg-1)和一個陽性對照組（環(huán)磷酰胺，按40mg.kg-1腹腔注射）及一個陰性對照組，按兩種方案（“0”和“24”小時兩次給藥和連續(xù)6周給藥）檢測牛黃解毒片對染色體的影響。結(jié)果表明，“0”與“24”小時兩次給藥，各劑量組與陰性對照組比較均無顯著性差異p＞0.05），提示本方案下，牛黃解毒片對小鼠體細(xì)胞染色體的完整性和染色體分離無明顯

7、影響。但給藥6w后，在劑量為1672mg.kg-1及3340mg.kg-1時，小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且各個劑量組之間存在明顯劑量反應(yīng)關(guān)系（r=0.999,P=0.023），提示給藥6w，牛黃解毒片可引起小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率增加。
　　 1.2.2.牛黃解毒片對小鼠生殖細(xì)胞遺傳損傷的影響采用經(jīng)口給藥，進(jìn)行小鼠精子畸形試驗。設(shè)立三個劑量組(3345、1670、835mg.k

8、g-l)和一個陽性對照組（環(huán)磷酰胺，按40mg.kg-l腹腔注射）及一個陰性對照組，按兩種方案（5d給藥和連續(xù)6周給藥）檢測牛黃解毒片對小鼠生殖細(xì)胞的遺傳損傷作用。結(jié)果顯示，兩種給藥方案，各劑量組與陰性對照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)，表明本實驗條件下，牛黃解毒片對小鼠生殖細(xì)胞無明顯遺傳損傷作用。
　　 1.2.3.牛黃解毒片對小鼠主要組織細(xì)胞DNA鏈斷裂作用的檢測采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)(SCGE)，檢測不同給藥劑量(3

9、345、1670、835mg.kg-1)及不同給藥時段(1w、2w、3w、4w和5w)的牛黃解毒片對小鼠外周血細(xì)胞DNA的斷裂情況，并于末次給藥后檢測牛黃解毒片對肺、肝、腎、脾細(xì)胞DNA的斷裂作用。結(jié)果顯示，給藥2w、3w時，高劑量組即可引起外周血淋巴細(xì)胞DNA鏈發(fā)生斷裂，給藥4w、5w時，高、中、低三個劑量均可引起外周血淋巴細(xì)胞DNA發(fā)生斷裂作用；牛黃解毒片經(jīng)口給藥6w后，高、中劑量組肝、肺細(xì)胞及高劑量組的腎細(xì)胞的DNA損傷與陰性對照

10、組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明牛黃解毒片經(jīng)口給藥6w可能會致肝、肺及腎細(xì)胞DNA損傷作用。
　　 初步結(jié)論：以上研究結(jié)果表明，在體內(nèi)、外實驗條件下，牛黃解毒片無明顯遺傳毒性作用，但隨著給藥劑量及給藥時間的延長，牛黃解毒片可能具有一定蓄積性的遺傳毒性。
　　 2.牛黃解毒片配伍減低雄黃砷毒性作用初探
　　 2.1.牛黃解毒片配伍對雄黃可溶性砷含量的影響采用原子熒光法測定牛黃解毒片全方及其不同拆方組中的可溶性砷鹽的含

11、量。結(jié)果顯示，不管是人工胃液還是人工腸液處理，牛黃解毒片全方配伍后，均可明顯降低雄黃中可溶性砷含量，并且，牛黃解毒片去甘草、黃芩、大黃后，其可溶性砷又明顯升高，這表明牛黃解毒片全方配伍對雄黃可能有減毒作用，而甘草、黃芩、大黃三味中藥可能是發(fā)揮減毒作用的藥物。
　　 2.2.牛黃解毒片配伍減低雄黃砷毒性的動物實驗研究
　　 2.2.1.牛黃解毒片配伍對雄黃中砷吸收分布的影響采用原子熒光光譜法測定并分析牛黃解毒片全方配伍對雄

12、黃中砷在機(jī)體內(nèi)的吸收與分布的影響。結(jié)果顯示，給藥9周后，雄黃組的肝、腎、脾、心、肺組織砷濃度均高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步證實雄黃中砷在機(jī)體內(nèi)可被吸收并分布。各組與全方組比較，雄黃組的肝、腎、脾、心、肺組織砷濃度均明顯高于全方組(P＜0.05)，而全方去甘草、黃芩、大黃組的肝、脾、心組織砷濃度明顯高于全方組（P＜0.05），這提示牛黃解毒片全方配伍后可減少雄黃中砷在機(jī)體內(nèi)的吸收與分布，并且去除甘草、黃芩、大黃

13、三味中藥后，部分機(jī)體組織對雄黃中砷的吸收可能增加。
　　 2.2.2.牛黃解毒片配伍對雄黃遺傳毒性的影響采用彗星技術(shù)、微核試驗等測定牛黃解毒片全方及其拆方對遺傳損傷的影響。研究顯示，與陰性對照組比較，單味雄黃組小鼠血細(xì)胞DNA損傷、骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成率增加及精子畸變率均升高(P＜0.05)；與雄黃組比較，牛黃解毒片全方組小鼠血細(xì)胞DNA損傷與微核形成率明顯降低(P＜0.05)，精子畸變率無明顯變化；全方去甘草、黃芩、大黃后

14、，與全方組比較，DNA損傷作用明顯增強，但微核形成率、精子畸形率未見明顯改變。表明牛黃解毒片配伍可能會減低雄黃的遺傳損傷作用，但具體藥味尚不能明確與甘草、黃芩、大黃有關(guān)。
　　 2.2.3.牛黃解毒片配伍對雄黃肝腎毒性的影響采用病理組織學(xué)觀察，分析牛黃解毒片配伍對雄黃肝腎毒性的影響。結(jié)果顯示，雄黃組肝組織細(xì)胞顯著水腫，局部有壞死；而腎臟組織出現(xiàn)局部腎小管細(xì)胞重度水腫；牛黃解毒片全方組及牛黃解毒片去雄黃組的肝腎組織未見明顯異常，表

15、明牛黃解毒片配伍能減低雄黃組肝腎毒性。
　　 2.2.4.牛黃解毒片配伍對肝腎組織氧化損傷的影響采用生物化學(xué)方法，測定各組肝腎組織脂質(zhì)過氧化物MDA含量、抗氧化酶SOD和GSH-px的活力。結(jié)果顯示，與陰性對照組及與牛黃解毒片全方組比較，雄黃組的肝、腎組織中GSH-px酶、SOD活力活力均顯著下降(P＜0.05)，而MDA均明顯升高（P＜0.05），這表明雄黃的肝腎毒性可能與氧化損傷作用有關(guān)，而牛黃解毒片配伍減低雄黃肝腎毒性可能

16、與抗氧化損傷有關(guān)。全方去甘草、黃芩、大黃組與全方組比較未見有明顯差異，提示甘草、黃芩、大黃三味藥在方中抗氧化尚不能明確。
　　 2.2.5.牛黃解毒片配伍對細(xì)胞凋亡的影響采用TUNNEL、免疫組化法測定牛黃解毒片配伍對肝細(xì)胞凋亡和凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，雄黃組的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，Bax表達(dá)平均光密度明顯增加，Bcl2表達(dá)平均光密度明顯減少（P＜0.05）；牛黃解毒片配伍后，TUNEL陽性細(xì)

17、胞數(shù)較雄黃組明顯減少，Bax表達(dá)平均光密度明顯減少，Bcl2表達(dá)平均光密度明顯增多(P＜0.05)。這表明誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡可能是雄黃引起肝損傷的可能機(jī)制：牛黃解毒片配伍對雄黃的誘導(dǎo)凋亡作用產(chǎn)生了抑制，抑制過程可能是通過促進(jìn)Bcl2表達(dá)而阻礙bax表達(dá)來實現(xiàn)的。全方去甘草、黃芩、大黃組凋亡細(xì)胞數(shù)較全方組增加，Bax表達(dá)明顯增加，但Bcl2表達(dá)無明顯變化。
　　 初步結(jié)論：牛黃解毒片配伍可以減低雄黃的砷毒性（肝腎毒性、遺傳毒性），甘草