殼聚糖酶OU01底物結(jié)合與催化機(jī)理研究.pdf

1、殼寡糖是具有多種生物學(xué)功能的生物活性物質(zhì)，在醫(yī)藥衛(wèi)生、食品、農(nóng)業(yè)等方面都具有廣泛的研究及應(yīng)用。在殼寡糖的制備方法中，以殼聚糖酶為基礎(chǔ)的酶降解法具有專一性強(qiáng)，酶切效率高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，正受到越來(lái)越多的關(guān)注。迄今為止，已經(jīng)從細(xì)菌、植物組織里發(fā)現(xiàn)了多種殼聚糖酶，對(duì)殼聚糖酶的基本性質(zhì)、水解方式等都開(kāi)展了研究。目前，已有三種殼聚糖酶單體的結(jié)構(gòu)得到解析，為殼聚糖酶的研究提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，但殼聚糖酶對(duì)底物的降解機(jī)制仍然不清楚。為此，本論文通

2、過(guò)培養(yǎng)酶與底物復(fù)合物晶體，解析復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，從分子水平上對(duì)殼聚糖酶與底物的結(jié)合機(jī)理進(jìn)行深入研究。本研究選取了酶活性較高的chitosanase OU01為研究對(duì)象，主要進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的工作:
　　1、從菌株Microbacterium sp.的基因組中克隆了不含信號(hào)肽的chitosanase OU01基因。將基因與pGEX-6p-1相連，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)中，構(gòu)建了chitosanaseOU01的原核表

3、達(dá)系統(tǒng)。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)了重組蛋白。通過(guò)親和層析、柱上酶切和凝膠過(guò)濾層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了分離純化，最終獲得高純度的chitosanase OU01，電泳結(jié)果顯示其分子量在30 kDa左右。
　　2、利用TLC，質(zhì)譜，NMR技術(shù)對(duì)chitosanase OU01的動(dòng)力學(xué)參數(shù)、酶解產(chǎn)物、水解動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究?；緞?dòng)力學(xué)參數(shù)如下:Km為4.197 mg/ml，最大反應(yīng)速率Vmax為0.049μmol/min，催化常數(shù)Kcat為1

4、2，297 min-1，比活力為476.6U/mg.protein;對(duì)脫乙酰度大于90％(DDA＞90％)殼聚糖進(jìn)行充分水解后得到的產(chǎn)物主要為殼二糖和殼三糖;水解脫乙酰度大于99％(DDA＞99％)殼聚糖的整體水解過(guò)程表現(xiàn)出先快后慢的非均一性動(dòng)力學(xué)過(guò)程。
　　3、參考序列比對(duì)，利用定點(diǎn)突變技術(shù)將兩個(gè)氨基酸（Glu25與Asp43）分別突變成Ala，獲得無(wú)催化活性的突變體，用于與殼六糖底物共混，進(jìn)行復(fù)合物結(jié)晶。經(jīng)過(guò)晶體生長(zhǎng)條件的篩選

5、與優(yōu)化，獲得了可用于X-射線衍射數(shù)據(jù)收集的復(fù)合物晶體。在此基礎(chǔ)上，對(duì)復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，首次獲得了殼聚糖酶與底物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDBID:4OLT;4QWP)。
　　4、復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析，進(jìn)一步從結(jié)構(gòu)角度確定了chitosanase OU01采用的是“inverting”催化機(jī)理，并首次闡明了催化關(guān)鍵氨基酸在催化反應(yīng)中的作用。
　　5、通過(guò)復(fù)合物結(jié)構(gòu)，首次揭示了chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部與每一個(gè)糖

6、單元的相互作用。通過(guò)定點(diǎn)突變，進(jìn)一步驗(yàn)證了chitosanase OU01結(jié)合口袋內(nèi)部對(duì)底物結(jié)合起重要作用的氨基酸。
　　6、綜合復(fù)合物結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和分子對(duì)接分析，確定了-2位是chitosanase OU01中的底物特異性識(shí)別位點(diǎn)，該位點(diǎn)只能結(jié)合氨基葡萄糖，屬于D-X-X（（-2）-(-1)-(+1))型底物特異性水解酶，該研究對(duì)chitosanase水解底物的特異性進(jìn)行了重新定義。
　　7、通過(guò)表面電荷分析與突變體活性

7、驗(yàn)證，尋找到了結(jié)合口袋之外對(duì)長(zhǎng)鏈殼聚糖底物的結(jié)合起重要作用的氨基酸Asp40。
　　8、依據(jù)關(guān)鍵氨基酸殘基對(duì)不同底物活性的影響及空間結(jié)構(gòu)，對(duì)參與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了分類，在此基礎(chǔ)上，闡明了兩類底物（寡糖底物和長(zhǎng)鏈底物）與酶的復(fù)合物形成機(jī)理，并首次提出了長(zhǎng)鏈底物與殼聚糖酶的“三步”結(jié)合原理。
　　9、通過(guò)復(fù)合物與文獻(xiàn)報(bào)道的殼聚糖酶單體的結(jié)構(gòu)比較，明確了“非連續(xù)”型殼聚糖酶在結(jié)構(gòu)上的兩個(gè)重要特征，一是結(jié)合口袋在水解過(guò)程中按