PERK-eIF2а-CHOP信號(hào)通路參與新生大鼠壞死性小腸結(jié)腸炎發(fā)病及魚(yú)油保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的：分別通過(guò)魚(yú)油、eIF2а去磷酸化抑制劑salubrinal干預(yù)，采用配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素聯(lián)合構(gòu)建壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）新生大鼠模型，動(dòng)態(tài)研究新生大鼠NEC發(fā)病過(guò)程中腸道組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）中PERK/eIF2а/CHOP信號(hào)通路中相關(guān)分子PERK、p-PERK、eIF2а、p-eIF2а、CHOP的表達(dá)，進(jìn)一步深入探討ERS信號(hào)通路在NEC發(fā)病

2、機(jī)制中的作用，并試圖揭示魚(yú)油對(duì)新生大鼠NEC腸道保護(hù)作用的可能分子機(jī)制，為臨床防治NEC提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：240只母乳喂養(yǎng)1日齡清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)新生大鼠，體質(zhì)量5-10 g，雌雄不限，母乳喂養(yǎng)至7日齡，體質(zhì)量13-18 g，隨機(jī)分為六組：NEC組（NEC組，n=40）、魚(yú)油干預(yù)組（FO組，n=40）、Salubrinal干預(yù)組（SAL組，n=40）、Salubrinal+魚(yú)油聯(lián)合干預(yù)組（S

3、F組，n=40）、對(duì)照組（CON1組，n=40）和二甲基亞砜對(duì)照組（CON2組，n=40）。NEC組：于生后第8天開(kāi)始每天采用配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃多因素聯(lián)合方法連續(xù)3天構(gòu)建NEC模型，造模同時(shí)每日予生理鹽水（NS）（0.6ml/100g.d）灌胃、腹腔內(nèi)注射NS(1ml/100g.d)各一次；FO組：于生后第8天開(kāi)始連續(xù)3天建立NEC模型（方法同上），造模同時(shí)每日予魚(yú)油（濃度為35％，劑量為0.6ml/100g.d）灌胃

4、、腹腔內(nèi)注射等量NS各一次；SAL組：于生后第8天開(kāi)始連續(xù)3天建立NEC模型（方法同上），造模同時(shí)每日等量NS灌胃、Salubrinal(1 mg/kg)腹腔注射各一次；SF組：于生后第8天開(kāi)始連續(xù)3天建立NEC模型（方法同上），造模同時(shí)每日魚(yú)油（濃度為35%，劑量為0.6ml/100g.d）灌胃、Salubrinal(1 mg/kg)腹腔注射各一次；CON1組：7日齡新生SD大鼠繼續(xù)母乳喂養(yǎng)，并于生后第8天開(kāi)始連續(xù)3天每日予等量NS灌

5、胃、腹腔內(nèi)注射等量NS各一次；CON2組：7日齡新生SD大鼠繼續(xù)母乳喂養(yǎng)，并于生后第8天開(kāi)始連續(xù)3天每日予等量NS灌胃、腹腔內(nèi)注射1%DMSO(1ml/100g.d)各一次。觀察六組新生大鼠造模0小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)五個(gè)時(shí)間點(diǎn)一般情況及72小時(shí)NEC發(fā)病率；并分別于造模過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取8只處死，留取十二指腸下端至直腸上端腸道組織，觀察腸道大體形態(tài)改變，取回盲部近端腸道組織HE染色病理組織學(xué)檢查結(jié)合腸道組織損傷

6、病理評(píng)分評(píng)估腸道損傷程度，采用Western-blot技術(shù)檢測(cè)PERK、p-PERK、eIF2а、p-eIF2а、CHOP蛋白表達(dá)水平，并采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)CHOP基因表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴六組新生大鼠外觀表現(xiàn)及一般情況：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，CON1組和CON2組新生大鼠活動(dòng)度良好，體重增長(zhǎng)良好，皮下脂肪豐滿，無(wú)腹脹，大便次數(shù)及性狀正常；自造模刺激開(kāi)始后NEC組大鼠相繼出現(xiàn)活動(dòng)度下降，反應(yīng)遲鈍，倦怠，呼吸增快，體重增長(zhǎng)緩慢，皮下脂

7、肪減少，皮膚松弛，腹脹，不同程度地解黃綠色粘液稀便，大便次數(shù)增多，隨造模時(shí)間延長(zhǎng)上述表現(xiàn)漸加重；SAL組、SF組和FO組大鼠表現(xiàn)介于兩者之間，活動(dòng)度尚可，大便次數(shù)稍增多，性狀尚可。⑵六組新生大鼠腸道大體形態(tài)、病理觀察及腸道損傷病理評(píng)分比較：CON1組、CON2組兩組新生大鼠腸道呈淡黃色，腸壁光滑完整，彈性可，無(wú)腸道發(fā)黑、腸腔擴(kuò)張等； NEC組新生大鼠腸道呈暗紫色或黑色，腸腔擴(kuò)張，腸壁變薄，局部有血栓形成； SAL組、SF組、FO組三組腸

8、道稍發(fā)黑、擴(kuò)張，少數(shù)有積氣；SF組、FO組兩組腸道大體形態(tài)較SAL組稍改善。HE染色后光鏡下觀察見(jiàn)CON1組、CON2組兩組各時(shí)間點(diǎn)腸粘膜絨毛完整，結(jié)構(gòu)正常；NEC組從12小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)輕度粘膜下和/或固有層腫脹分離，漸進(jìn)展為72小時(shí)局部腸絨毛脫落伴壞死，中重度粘膜層、固有層分離，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；SAL組、SF組、FO組三組從24小時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)輕度粘膜下和/或固有層腫脹分離，漸進(jìn)展為72小時(shí)時(shí)局部腸絨毛脫離，輕中度粘膜層、固有層分離，炎

9、癥細(xì)胞浸潤(rùn)等改變；與CON1組、CON2組比較，NEC組腸道損傷病理評(píng)分在12、24、48、72小時(shí)均顯著升高（均P<0.05），SAL組、SF組、FO組三組病理評(píng)分在24、48、72小時(shí)均顯著升高（均P<0.05）；與NEC組相比，SAL組、SF組、FO組三組病理評(píng)分在12、24、48、72小時(shí)均顯著降低（均P<0.05）。⑶六組新生大鼠72小時(shí)NEC發(fā)病率比較：CON1組和CON2組新生大鼠無(wú)一例發(fā)生NEC；NEC組有7只發(fā)生NEC

10、，其發(fā)病率為87.5%；SAL組有4只發(fā)生NEC，其發(fā)病率為50%；SF組有3只發(fā)生NEC，其發(fā)病率為37.5%；FO組有3只發(fā)生NEC，其發(fā)病率為37.5%。與CON1組、CON2組相比，NEC組、SAL組、SF組和FO組四組NEC發(fā)病率均顯著升高（均P<0.01）；與NEC組相比，SAL組、SF組和FO組三組NEC發(fā)病率均顯著降低（均P<0.01）。⑷六組新生大鼠腸道組織中PERK、p-PERK蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)水平比較：CON1組、CO

11、N2組、NEC組、SAL組、SF組和FO組六組組間及組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)PERK蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯差異(均P>0.05)；CON1組、CON2組兩對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)p-PERK蛋白的表達(dá)均無(wú)顯著差異(均P>0.05)；NEC組、SAL組p-PERK蛋白表達(dá)在12小時(shí)開(kāi)始升高，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，于72小時(shí)達(dá)峰；SF組、FO組p-PERK蛋白表達(dá)在12小時(shí)開(kāi)始升高，24小時(shí)達(dá)到高峰后呈下降趨勢(shì)；與對(duì)照組相比，NEC組、SAL組、SF組

12、、FO組四組p-PERK蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均增高（均P<0.05)；與NEC組相比，SAL組p-PERK蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異（均P>0.05），SF組、FO組兩組p-PERK蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0.05)；與SAL組相比，SF組、FO組兩組p-PERK蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0.05)；SF組、F

13、O組兩組p-PERK蛋白表達(dá)相比在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異（均P>0.05）。⑸六組新生大鼠腸道組織中eIF2а、p-eIF2а蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)水平比較：CON1組、CON2組、NEC組、SAL組、SF組和FO組六組組間及組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)eIF2а蛋白表達(dá)均無(wú)顯著差異(均P>0.05)；兩對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)p-eIF2а蛋白表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；NEC組、SAL組、SF組和FO組四組p-eIF2а蛋白

14、表達(dá)在12小時(shí)開(kāi)始升高，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，于72小時(shí)達(dá)峰；與對(duì)照組相比，NEC組、SAL組、SF組和FO組四組p-eIF2а蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均增高（均P<0.05)；與NEC組比較，SAL組p-eIF2а蛋白表達(dá)在0、12小時(shí)無(wú)顯著差異（P>0.05），而在24、48、72小時(shí)明顯增高（均P<0.05），SF組、FO組兩組p-eIF2а蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0

15、.05）；與SAL組相比，SF組、FO組兩組p-eIF2а蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0.05)；SF組、FO組兩組p-eIF2а蛋白表達(dá)相比在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異（均P>0.05）。⑹六組新生大鼠腸道組織中CHOP蛋白動(dòng)態(tài)表達(dá)水平比較：CON1組、CON2組兩對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)CHOP蛋白的表達(dá)均無(wú)明顯差異(均P>0.05)；NEC組CHOP蛋白表達(dá)在12小時(shí)即明顯升高，且

16、隨造模時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，于72小時(shí)達(dá)峰；SAL組CHOP蛋白表達(dá)在24小時(shí)即明顯升高，且呈遞增趨勢(shì)，于72小時(shí)達(dá)峰；SF組、FO組CHOP蛋白表達(dá)在24小時(shí)稍升高，與12小時(shí)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），自48小時(shí)起CHOP蛋白表達(dá)明顯升高，于72小時(shí)達(dá)峰；與對(duì)照組比較，NEC組CHOP蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)均增高（均P<0.05)，SAL組CHOP蛋白表達(dá)在24、48、72小時(shí)增高（均P<0.05)，SF組、F

17、O組兩組CHOP蛋白表達(dá)在48、72小時(shí)表達(dá)增高（均P<0.05)；與NEC組相比，SAL組、SF組和FO組三組CHOP蛋白表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)均降低（均P<0.05)；與SAL組相比，SF組、FO組兩組CHOP蛋白表達(dá)在24、48、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0.05)；SF組、FO組兩組CHOP蛋白表達(dá)相比在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異（均P>0.05）。⑺六組新生大鼠腸道組織中CHOPmRNA基

18、因動(dòng)態(tài)表達(dá)水平比較：CON1組、CON2組兩對(duì)照組組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)CHOPmRNA的表達(dá)均無(wú)明顯差異(均P>0.05)；NEC組CHOPmRNA表達(dá)在12小時(shí)開(kāi)始明顯升高，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，于72小時(shí)達(dá)峰；SAL組CHOPmRNA表達(dá)在12小時(shí)即明顯升高，且隨造模時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸增高，于72小時(shí)達(dá)峰；SF組、FO組CHOPmRNA表達(dá)在12小時(shí)稍增高，自24小時(shí)起CHOP mRNA表達(dá)明顯升高，于72小時(shí)達(dá)峰。組間比較：與對(duì)照組

19、相比，NEC組、SAL組兩組CHOPmRNA表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)均增高（均P<0.05)，而SF組、FO組兩組CHOPmRNA表達(dá)則在24、48、72小時(shí)增高（均P<0.05）；與NEC組相比，SAL組、SF組和FO組三組CHOPmRNA表達(dá)在12、24、48、72小時(shí)均降低（均P<0.05)；與SAL組相比，SF組CHOPmRNA表達(dá)在24、48、72小時(shí)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0.05)；FO組CHOPmRNA表達(dá)在24

20、、72小時(shí)兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均降低（均P<0.05)；SF組、FO組兩組CHOPmRNA表達(dá)相比在12、24、48、72小時(shí)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異（均P>0.05）。
　　結(jié)論：①配方奶喂養(yǎng)+缺氧+冷刺激+LPS灌胃等多種致病危險(xiǎn)因素可成功構(gòu)建NEC模型。②腸道組織ERS的PERK/eIF2а/CHOP信號(hào)通路相關(guān)分子p-PERK、p-eIF2а、CHOP蛋白及CHOPmRNA基因的表達(dá)在NEC模型組中均升高，且隨造模刺激時(shí)間延長(zhǎng)呈進(jìn)行性

21、升高；而SAL組中p-eIF2а蛋白表達(dá)升高、CHOP蛋白及CHOPmRNA的表達(dá)降低，NEC大鼠腸道損傷改善，提示PERK/eIF2а/CHOP信號(hào)通路參與新生大鼠NEC的發(fā)生、發(fā)展，而salubrinal可能通過(guò)抑制ERS信號(hào)通路中p-eIF2а去磷酸化、抑制CHOP基因及蛋白的表達(dá)而起作用。③魚(yú)油能降低 NEC大鼠腸道組織中 p-PERK、p-eIF2а、CHOP蛋白及CHOPmRNA基因的表達(dá)，減輕NEC大鼠腸道損傷的程度，提示