miR-16-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)及對細(xì)胞生長、侵襲和凋亡的影響.pdf

1、為了探究miR-16-5p在乳腺癌中的表達(dá)及作用，筆者進行以下幾個方面的研究:一、乳腺癌組織中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表達(dá)及其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系;二、上調(diào)miR-16-5p的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;三、miR-16-5p對HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用機制研究。
　　第一部分 乳腺癌組織中miR-16-5p、HIF-1α、VEGF的表達(dá)及其與患者臨

2、床病理學(xué)特征的關(guān)系
　　方法:
　　1.采集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科74例手術(shù)切除乳腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本。
　　2.采用Agilent miRNA芯片技術(shù)檢測3例乳腺癌組織及相對應(yīng)的癌旁正常乳腺組織標(biāo)本中miRNA的表達(dá)情況。
　　3.運用熒光定量PCR檢測74例樣本中miR-16-5p和HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)。
　　4.采用Western Blot技術(shù)檢測HIF-1α

3、和VEGF的蛋白表達(dá)情況。
　　5.分析miR-16-5p、HIF-1α、VEGF mRNA的表達(dá)與乳腺癌患者性別、年齡、組織學(xué)分級、TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　6.采用SPSS21.0.軟件進行統(tǒng)計分析，檢驗水準(zhǔn)a=0.05。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)Agilent miRNA芯片檢測分析，在乳腺癌組織中共有86個miRNAs表達(dá)異常，其中46個上調(diào)，40個下調(diào)。miR-16-5p在乳腺非特殊型浸

4、潤性癌中呈高表達(dá)。
　　2.qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-16-5p在乳腺癌組織中的表達(dá)較正常乳腺組織顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　3.qRT-PCR結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的mRNA水平表達(dá)量均顯著高于癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.Western blot結(jié)果顯示，HIF-1α、VEGF在乳腺癌組織中的蛋白水平表達(dá)量均顯著高于癌旁正常組織，差

5、異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.乳腺癌組織中miR-16-5p以及HIF-1α與VEGF的mRNA表達(dá)水平與患者的組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P均＜0.05）;
　　結(jié)論:
　　1.在乳腺癌組織中，miR-16-5p表達(dá)水平較正常乳腺組織顯著降低，提示其可能在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。
　　2.miR-16-5p可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，且可能與HIF-1α和VEGF的表達(dá)密切相

6、關(guān)。
　　第二部分 上調(diào)miR-16-5p的表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞生物學(xué)作用的影響
　　方法:
　　1.采用Real-time PCR檢測乳腺癌細(xì)胞中miR-16-5p在不同乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-468，T47D以及正常乳腺細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)。
　　2.慢病毒感染MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，篩選得到穩(wěn)定表

7、達(dá)miR-16-5p的細(xì)胞株，采用實時定量PCR檢測慢病毒感染后MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中miR-16-5p的表達(dá)。
　　3.本實驗分為三組:實驗組（重組miR-16-5p慢病毒感染細(xì)胞），空白組（未處理的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞）和陰性對照組（miR-NC慢病毒感染細(xì)胞）。
　　4.本課題采用CCK-8法、平板克隆形成實驗對各組細(xì)胞增殖和生長能力進行檢測。
　　5.AnnexinⅤ-APC/P

8、I雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色法對各組細(xì)胞的凋亡情況進行檢測。采用侵襲實驗對各組細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力進行檢測。
　　6.裸鼠移植瘤實驗檢測miR-16-5p過表達(dá)對乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響，并采用免疫組織化學(xué)檢測HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.miR-16-5p在MCF-7,MDA-MB-231,MDA-MB-435,MDA-MB-468,T47D乳腺癌細(xì)

9、胞株中mRNA水平較MCF-10A的表達(dá)均有所下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中以MCF-7和MDA-MB-231下降最為顯著。
　　2.成功構(gòu)建含miR-16-5p序列的慢病毒載體，穩(wěn)定高表達(dá)組中LV1-miR-16-5p在MCF-7中的表達(dá)量約為空白細(xì)胞組的6.41倍，在MDA-MB-231中的表達(dá)量約為空白細(xì)胞組的4.56倍。
　　3.通過CCK-8法檢測，結(jié)果表明miR-16-5p組與空白對照組和陰性對照

10、組相比，吸光度減少顯著。平板克隆形成實驗結(jié)果表明miR-16-5p組細(xì)胞克隆形成數(shù)較無關(guān)對照組和空白對照組顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.AnnexinⅤ-APC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst染色檢測顯示重組miR-16-5p慢病毒感染后MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率較空白對照組與陰性對照組顯著升高。
　　5.侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，MCF-7實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)為（49.0±5.1）個，相比

11、于空白對照組和陰性對照組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。MDA-MB-231實驗組穿膜細(xì)胞數(shù)為（42.0±7.1）個，與空白對照組和無關(guān)對照組相比顯著減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.裸鼠移植瘤實驗表明實驗組腫瘤組織體積和正常對照組相比明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。瘤組織免疫組化結(jié)果顯示，實驗組Hif和VEGF表達(dá)較正常對照組和陰性對照組明顯減少。
　　結(jié)論:
　　

12、1.成功建立了過表達(dá)miR-16-5p的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株。
　　2.體外上調(diào)乳腺癌細(xì)胞中miR-16-5p表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長、降低其侵襲能力，促進細(xì)胞的凋亡。動物實驗表明miR-16-5p過表達(dá)能有效抑制裸鼠移植瘤生長。
　　第三部分 miR-16-5p對HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用機制的初步研究
　　方法:
　　1.通過生物信息學(xué)分析預(yù)測miR-16-5p的下游靶基

13、因。
　　2.設(shè)計靶向HIF-1α和VEGF的siRNA序列，轉(zhuǎn)染至MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞。分為以下幾組:未轉(zhuǎn)染的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞（Blank組）、miR-16-5p慢病毒感染的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞（miR-16-5p組）、HIF-1αsiRNA干擾表達(dá)的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞以及VEGF siRNA干擾表達(dá)的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞。通過qRT-PCR、

14、Western blot檢測各組細(xì)胞Hif/VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，CCK-8法檢測各組之間細(xì)胞增殖，AnnexinⅤ-APC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組之間的凋亡情況，侵襲實驗檢測各組之間的侵襲能力。通過western blot的方法檢測不同HIF-1α和VEGF以及miR-16-5p表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞增殖，凋亡以及侵襲等相關(guān)蛋白的影響。
　　3.構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-HIF-1α、pcDNA3.1-VEGF，通

15、過回復(fù)實驗分析miR-16-5p對HIF-1α和VEGF生物學(xué)活性的調(diào)控。
　　結(jié)果:
　　1.HIF-1α和VEGF是miR-16-5p的預(yù)測靶基因。
　　2.MiR-16-5p不改變HIF-1α和VEGF的轉(zhuǎn)錄水平，但顯著影響其蛋白的水平，但siRNA干擾后，其HIF-1α和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。
　　3.HIF-1α和VEGF的過表達(dá)明顯恢復(fù)miR-16-5p過表達(dá)細(xì)胞系MCF-7和MDA-

16、MB-231中HIF-1α和VEGF蛋白的表達(dá)。
　　4.HIF-1α和VEGF過表達(dá)能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-16-5p過表達(dá)對乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的促凋亡情況。
　　5.HIF-1α和VEGF過表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231的侵襲能力顯著增高，且能夠明顯逆轉(zhuǎn)miR-16-5p過表達(dá)對乳腺癌侵襲能力的抑制作用。
　　6.miR-16-5p的過表達(dá)與HIF-1α和VEGF的沉默能

17、協(xié)同性降低細(xì)胞的侵襲能力，促進細(xì)胞的凋亡，同時轉(zhuǎn)染后，BAD，BAX，和cleaved caspase3的表達(dá)顯著上升，MMP-9，p-AKT以及HIF-1α的表達(dá)均顯著降低。
　　結(jié)論:
　　1.miR-16-5p通過HIF-1α和VEGF發(fā)揮抑制乳腺癌的作用。
　　2.操縱miR-16-5p可能成為未來乳腺癌潛在的分子治療靶點。
　　全文結(jié)論:
　　1.乳腺癌組織中，miR-16-5p表達(dá)水平較正常組織