過表達(dá)CXCL12促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成血管相關(guān)因子表達(dá)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　牙周膜干細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是間充質(zhì)來源的干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，是骨組織工程種子細(xì)胞的重要來源之一[1-3]。骨組織再生過程復(fù)雜，受多種細(xì)胞因子及信號通路的調(diào)節(jié)[4]。趨化因子CXCL12可通過在機(jī)體損傷部位募集MSCs促進(jìn)組織的修復(fù)和再生，是重要的MSCs調(diào)節(jié)因子之一[5-6]，最新研究顯示CXCL12可能直接

2、參與組織修復(fù)中的血管再生過程[7-8]，但CXCL12調(diào)控PDLSCs促進(jìn)血管生成的作用還未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，探討人PDLSCs過表達(dá)CXCL12后成血管相關(guān)因子的表達(dá)情況以及促進(jìn)大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損修復(fù)的作用，希望可以為骨組織再生的臨床治療提供一定的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.人牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及鑒定:酶消化法分離培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞，油紅O脂類染色及堿性磷酸酶染色確定PDLSCs

3、的多向分化潛能，流式細(xì)胞術(shù)檢測PDLSCs的間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)，明確原代培養(yǎng)的PDLSCs具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性及多向分化潛能。
　　2.過表達(dá)CXCL12促進(jìn)人PDLSCs成血管相關(guān)因子表達(dá)的體外研究:利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將CXCL12慢病毒載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入人牙周膜干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后1天、4天、7天、14天利用real-time PCR檢測成血管相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平，Western Blot蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測成血管相關(guān)因子的

4、蛋白表達(dá)水平;病毒轉(zhuǎn)染后4小時(shí)和48小時(shí)，利用Matrigel類毛細(xì)血管形成實(shí)驗(yàn)檢測類毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)形成能力。
　　3.過表達(dá)CXCL12促進(jìn)人PDLSCs成血管相關(guān)因子表達(dá)的體內(nèi)研究:構(gòu)建SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損動(dòng)物模型，利用β-磷酸三鈣(β-TCP)體外構(gòu)建細(xì)胞材料復(fù)合體，植入SD大鼠顱骨缺損部位;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)共分為4組:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP組，Lenti-GFP/PDLS Cs/β-TCP組，

5、PDLSCs/β-TCP組，β-TCP組。2個(gè)月后，通過蘇木素伊紅染色檢測缺損部位的新骨形成，micro-CT對缺損部位形成的新骨進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，免疫組織化學(xué)檢測缺損部位的成血管相關(guān)因子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.酶消化法成功獲得PDLSCs，流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞高表達(dá)CD90、CD44和CD105，低表達(dá)CD146，不表達(dá)CD45，表明其具有間充質(zhì)來源干細(xì)胞特性;油紅O脂類染色及堿性磷酸酶染色，結(jié)果為陽性，確定所

6、獲得的PDLSCs具有成脂及成骨的多向分化潛能。
　　2.當(dāng)MOI=5時(shí)，慢病毒轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率大于90％。real-time PCR結(jié)果顯示:與對照組相相比，CXCL12過表達(dá)組中成血管相關(guān)因子VEGF、bFGF、PLGF和SCF的mRNA表達(dá)水平較高，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);Western Blot結(jié)果顯示:病毒轉(zhuǎn)染后，各組內(nèi)成血管相關(guān)因子VEGF、bFGF、PLGF和SCF的表達(dá)隨著時(shí)間的推移而逐漸增高，

7、而CXCL12過表達(dá)組中成血管相關(guān)因子蛋白表達(dá)水平明顯高于對照組，且具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);Matrigel類毛細(xì)血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，CXCL12過表達(dá)組可以形成更明顯的類毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。
　　3.SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損模型構(gòu)建成功;蘇木素伊紅染色結(jié)果顯示:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP組中缺損部位被大量的紅染物質(zhì)填充，提示有更多的新骨樣結(jié)構(gòu)形成;micro-CT分析結(jié)果提

8、示:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP組中骨缺損部位幾乎被新骨充填，BMD值，BV/TV值均高于對照組，且具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:Lenti-CXCL12-GFP/PDLSCs/β-TCP組缺損部位有更多的成血管相關(guān)因子VEGF、bFGF、PLGF和SCF的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.CXCL12可以促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞高表達(dá)成血管相關(guān)因