硫化葉菌CRISPR-Cas系統(tǒng)Csa3a對aCas基因轉(zhuǎn)錄激活的研究.pdf

1、CRISPR/Cas(ClusteredRegularlyImerspacedShortPalindromicRepeats)系統(tǒng)是廣泛存在于細(xì)菌和古菌中抵抗外源核酸入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。該系統(tǒng)具有三個(gè)基本功能:1、剪切并整合來自外源核酸的間隔序列;2、轉(zhuǎn)錄并加工間隔序列為成熟的crRNA;3、用所獲得的crRNA標(biāo)靶并剪切再次入侵的核酸。本研究利用冰島硫化葉菌同源雙交換敲除體系成功敲除冰島硫化葉菌E233S基因組CRISPR位點(diǎn)中cs

2、a3a、cmr2a、cmr2b和csa2四個(gè)基因，并對△csa3a、△cmr2a、△cmr2b三個(gè)缺失菌株的CRISPR/Cas系統(tǒng)切割穿梭質(zhì)粒的功能(即以DNA或RNA為靶標(biāo)的特異性切割功能)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明csa3a、cmr2a、cmr2b三個(gè)基因的缺失并不影響宿主對含間隔同源序列的外源遺傳物質(zhì)的切割。從該結(jié)果可以判斷csa3a基因不參與CRISPR/Cas免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄干擾功能，且cmr2基因的兩個(gè)拷貝中缺失任何一個(gè)拷貝都不影響

3、轉(zhuǎn)錄、干擾的進(jìn)行。
　　 本研究在△csa3a缺失菌株和其互補(bǔ)超表達(dá)菌株OEcsa3a基礎(chǔ)上，對與免疫適應(yīng)階段相關(guān)的基因(即acas基因，包括csa1、cas1、cas2和cas4)基因進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測。結(jié)果表明Csa3a蛋白超表達(dá)對aCas基因具有轉(zhuǎn)錄激活作用。繼而利用EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)Csa3a調(diào)控蛋白可以特異性地結(jié)合csa1啟動(dòng)子。通過逐步截短csa1啟動(dòng)子序列長度以縮小結(jié)合位點(diǎn)范圍，并將Csa3a結(jié)合位點(diǎn)定位在