志賀菌、大腸桿菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)分布及其與毒力和耐藥的關系.pdf

1、志賀菌是感染性腹瀉的病原體之一，可引起細菌性痢疾；致病性大腸桿菌可引起腸內和腸外感染；強毒株和（或）多耐藥株的出現(xiàn)嚴重危害人類的健康。近年來由于抗生素的廣泛使用，環(huán)境中的敏感菌在抗生素長期低濃度誘導下，可成為耐藥菌或多耐藥菌（MDR）。環(huán)境與臨床分離大腸桿菌耐藥性和耐藥基因方面的差異已有報道，但是對于二者CRISPR位點分布的研究尚未發(fā)現(xiàn)。
　　目的:
　　1.通過描述志賀菌、臨床和環(huán)境分離大腸桿菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)

2、、耐藥表型、耐藥基因、毒力表型和毒力基因的分布，探討CRISPR/Cas系統(tǒng)與耐藥和毒力之間的關系。
　　2.分析志賀菌中插入序列IS600對CRISPR相關蛋白基因cse2 mRNA表達水平的影響及其與耐藥和毒力的關系。
　　方法:
　　1. PCR擴增 CRISPR位點并測序，通過 CRISPR Finder軟件分析測序結果，CRISPR Target軟件分析間隔序列。
　　2.改良Kirby-Bauer（K

3、-B）紙片法進行藥敏試驗，PCR擴增耐藥基因。
　　3.臺盼藍細胞計數(shù)實驗檢測細菌毒性，PCR擴增毒力基因。
　　4.采用Real-time PCR（RT-PCR）方法檢測CRISPR相關蛋白基因cse2 mRNA表達水平。
　　5.采用選擇培養(yǎng)基方法分離水體中腸桿菌，通過16srRNA方法聯(lián)合美國梅里埃API生化試紙條鑒定細菌。
　　結果:
　　1. CRISPR位點檢測結果：33株志賀菌、40株臨床分離

4、大腸桿菌、32株環(huán)境分離大腸桿菌均能檢出CRISPR1、2、3位點，經CRISPR Finder軟件分析均為CRISPR位點，共檢出1469條間隔序列，包含376條特異性的間隔序列。通過CRISPR Target軟件尋找同源質粒或噬菌體所對應的編碼產物，匹配上的間隔序列有60條。臨床分離大腸桿菌CRISPR3位點檢出率高于環(huán)境分離株，且差異有統(tǒng)計學意義。
　　2. CRISPR位點與耐藥表型、耐藥基因的關系：33株志賀菌對AMP、

5、TCY、SXT、NOR、CL等抗生素耐藥率依次為42.42％、72.73%、81.82%、12.12%、30.30%；cat、sul2、blaCTX等耐藥基因陽性率依次為54.55%、66.67%、57.58%。環(huán)境分離大腸桿菌中，CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3與阿莫西林棒酸分布差異均有統(tǒng)計學意義。臨床分離大腸桿菌中，CRISPR1、CRISPR2與復方新諾明分布差異均有統(tǒng)計學意義。
　　3. CRISPR位點與毒

6、力表型、毒力基因的關系：33株志賀菌中毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、virA、icsA、icsP的檢出率依次為100.00%、100.00%、75.76%、84.85%、87.88%、84.85%；志賀菌侵染Hela細胞后死亡率范圍為3.0%-42.5%。CRISPR1位點陽性志賀菌致Hela細胞死亡率較陰性菌低，差異有統(tǒng)計學意義。大腸桿菌 CRISPR2與毒力基因 ial分布差異有統(tǒng)計學意義。
　　4.插入序列IS60

7、0對cse2 mRNA表達水平的影響：33株志賀菌中cse2陽性率為93.94%（31/33），其中無IS600的細菌有12株，有IS600的有19株，有IS600細菌cse2表達水平低于無IS600菌，且差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.細菌的分離與鑒定：水中共分離86株細菌，包括腸桿菌科74株，氣單胞菌5株，芽孢桿菌3株，假單胞菌2株，胡蘿卜軟腐果膠桿菌1株，噬線蟲共生菌1株。
　　6.環(huán)境與臨床分離大腸桿菌耐藥表型比較：臨床

8、分離大腸桿菌的AMP、CTX、FEP、CN、CIP、LEV、TE、SXT等抗生素的耐藥率均高于環(huán)境分離株，差異均有統(tǒng)計學意義；環(huán)境分離大腸桿菌的AK耐藥率高于臨床分離株，差異有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　1.志賀菌和大腸桿菌中CRISPR位點分布廣泛，檢出率高。
　　2.志賀菌中CRISPR1位點陰性菌毒力強；未發(fā)現(xiàn)CRISPR位點與耐藥分布有關。
　　3.志賀菌中插入序列IS600使cse2 mRNA表達水平