志賀菌、大腸桿菌中CRISPR-Cas系統(tǒng)分布及其與毒力和耐藥的關(guān)系.pdf

1、志賀菌是感染性腹瀉的病原體之一，可引起細(xì)菌性痢疾；致病性大腸桿菌可引起腸內(nèi)和腸外感染；強(qiáng)毒株和（或）多耐藥株的出現(xiàn)嚴(yán)重危害人類的健康。近年來(lái)由于抗生素的廣泛使用，環(huán)境中的敏感菌在抗生素長(zhǎng)期低濃度誘導(dǎo)下，可成為耐藥菌或多耐藥菌（MDR）。環(huán)境與臨床分離大腸桿菌耐藥性和耐藥基因方面的差異已有報(bào)道，但是對(duì)于二者CRISPR位點(diǎn)分布的研究尚未發(fā)現(xiàn)。
　　目的:
　　1.通過(guò)描述志賀菌、臨床和環(huán)境分離大腸桿菌中CRISPR/Cas系統(tǒng)

2、、耐藥表型、耐藥基因、毒力表型和毒力基因的分布，探討CRISPR/Cas系統(tǒng)與耐藥和毒力之間的關(guān)系。
　　2.分析志賀菌中插入序列IS600對(duì)CRISPR相關(guān)蛋白基因cse2 mRNA表達(dá)水平的影響及其與耐藥和毒力的關(guān)系。
　　方法:
　　1. PCR擴(kuò)增 CRISPR位點(diǎn)并測(cè)序，通過(guò) CRISPR Finder軟件分析測(cè)序結(jié)果，CRISPR Target軟件分析間隔序列。
　　2.改良Kirby-Bauer（K

3、-B）紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增耐藥基因。
　　3.臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)菌毒性，PCR擴(kuò)增毒力基因。
　　4.采用Real-time PCR（RT-PCR）方法檢測(cè)CRISPR相關(guān)蛋白基因cse2 mRNA表達(dá)水平。
　　5.采用選擇培養(yǎng)基方法分離水體中腸桿菌，通過(guò)16srRNA方法聯(lián)合美國(guó)梅里埃API生化試紙條鑒定細(xì)菌。
　　結(jié)果:
　　1. CRISPR位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果：33株志賀菌、40株臨床分離

4、大腸桿菌、32株環(huán)境分離大腸桿菌均能檢出CRISPR1、2、3位點(diǎn)，經(jīng)CRISPR Finder軟件分析均為CRISPR位點(diǎn)，共檢出1469條間隔序列，包含376條特異性的間隔序列。通過(guò)CRISPR Target軟件尋找同源質(zhì)?；蚴删w所對(duì)應(yīng)的編碼產(chǎn)物，匹配上的間隔序列有60條。臨床分離大腸桿菌CRISPR3位點(diǎn)檢出率高于環(huán)境分離株，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2. CRISPR位點(diǎn)與耐藥表型、耐藥基因的關(guān)系：33株志賀菌對(duì)AMP、

5、TCY、SXT、NOR、CL等抗生素耐藥率依次為42.42％、72.73%、81.82%、12.12%、30.30%；cat、sul2、blaCTX等耐藥基因陽(yáng)性率依次為54.55%、66.67%、57.58%。環(huán)境分離大腸桿菌中，CRISPR1、CRISPR2、CRISPR3與阿莫西林棒酸分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床分離大腸桿菌中，CRISPR1、CRISPR2與復(fù)方新諾明分布差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3. CRISPR位點(diǎn)與毒

6、力表型、毒力基因的關(guān)系：33株志賀菌中毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、virA、icsA、icsP的檢出率依次為100.00%、100.00%、75.76%、84.85%、87.88%、84.85%；志賀菌侵染Hela細(xì)胞后死亡率范圍為3.0%-42.5%。CRISPR1位點(diǎn)陽(yáng)性志賀菌致Hela細(xì)胞死亡率較陰性菌低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。大腸桿菌 CRISPR2與毒力基因 ial分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.插入序列IS60

7、0對(duì)cse2 mRNA表達(dá)水平的影響：33株志賀菌中cse2陽(yáng)性率為93.94%（31/33），其中無(wú)IS600的細(xì)菌有12株，有IS600的有19株，有IS600細(xì)菌cse2表達(dá)水平低于無(wú)IS600菌，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.細(xì)菌的分離與鑒定：水中共分離86株細(xì)菌，包括腸桿菌科74株，氣單胞菌5株，芽孢桿菌3株，假單胞菌2株，胡蘿卜軟腐果膠桿菌1株，噬線蟲(chóng)共生菌1株。
　　6.環(huán)境與臨床分離大腸桿菌耐藥表型比較：臨床

8、分離大腸桿菌的AMP、CTX、FEP、CN、CIP、LEV、TE、SXT等抗生素的耐藥率均高于環(huán)境分離株，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；環(huán)境分離大腸桿菌的AK耐藥率高于臨床分離株，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.志賀菌和大腸桿菌中CRISPR位點(diǎn)分布廣泛，檢出率高。
　　2.志賀菌中CRISPR1位點(diǎn)陰性菌毒力強(qiáng)；未發(fā)現(xiàn)CRISPR位點(diǎn)與耐藥分布有關(guān)。
　　3.志賀菌中插入序列IS600使cse2 mRNA表達(dá)水平