空腸彎曲桿菌中Cas9基因與毒力的關系研究.pdf

1、近年來由空腸彎曲桿菌感染引起的人類及動物性疾病越來越多，為了更好的預防和控制疾病的產生，必需更加清楚的了解致病菌毒性產生的機制和原因。另外由CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)和Cas基因(CRISPR-associated)組成的CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細菌的一種適應性免疫系統(tǒng)，被發(fā)現(xiàn)其與細菌的毒力有密切的相關性。CRISPR-Cas系統(tǒng)通

2、過整合外源的DNA進入CRISPR序列中，來識別二次入侵的外源DNA從而將外源DNA降解，達到抵抗外源可遺傳物質入侵的目的。既然CRISPR-Cas系統(tǒng)可以阻止外源DNA對自身的損害，那么CRISPR-Cas系統(tǒng)是否也可以使細菌能夠更快或更慢的進入到其他的生物體中。近十年來，CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術已經在不同的生物體中被應用。雖然CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯技術在不同的生物體中都被應用，但

3、是它對細菌的作用，卻還停留在適應性免疫防御的作用，對細菌毒力方面的作用，目前還很少有相關的文獻報道。所以本課題研究的目的是了解肉雞空腸彎曲桿菌NCTC11168中Cas9基因和毒力之間的關系。主要從兩個方面來探討Cas9和毒力的關系，一方面從毒力表型考察，另一方面從毒力基因型探討。通過結合這兩個方面，全面了解Cas9和細菌毒力的關系，從而為解決空腸彎曲桿菌的風險管理和危害控制提供更多的理論依據(jù)。
　　采取融合PCR技術構建同源重組

4、載體。在Cas9基因的上游和下游各擴增1300bp左右的片段，并擴增出Kan基因，大小約1200bp作為篩選基因，然后將這三個片段按照融合PCR的方法以上游片段-Kan基因-下游片段的順序連接起來，最后再連接到pGEM-Teasy載體上，構建出同源重組載體p3HKan5H。將p3HKan5H載體通過電轉化和自然轉化進入空腸彎曲桿菌NCTC11168中，篩選出突變菌，并進行突變體的驗證。
　　測定野生菌與突變菌的生長能力、鞭毛的形態(tài)

5、和遷移力、生物膜的情況，來考察Cas9基因對細菌自身毒力表型的影響。測定的生長力的結果顯示:采用t檢測的方法考察，野生型菌與突變菌的生長力并沒有顯著性差異。遷移力的結果顯示:野生型菌的遷移力明顯比突變菌強，兩者之間存在著顯著的差異性。遷移力主要與細菌的鞭毛運動有關，既然遷移力有顯著的差異性，可能Cas9基因對細菌的鞭毛有一定的作用。所以采用冷凍透射電鏡觀察鞭毛的形態(tài)，觀察其是否有顯著的變化，但是結果顯示，野生型菌與突變菌的兩極都存有較長

6、的且完整的鞭毛，說明敲除Cas9基因后，鞭毛的形態(tài)并沒有發(fā)生顯著變化。生物膜結果顯示:突變菌的生物膜的形成能力比野生菌的弱?？梢猿醪秸f明Cas9基因對空腸彎曲桿菌的毒力是有一定的影響的。
　　測定了細菌本身的毒力變化外，還需要對細菌的體外毒性進行檢測，包括檢測菌株對細胞的侵襲力和粘附力，以及菌株在體外的生存能力。實驗采用鼠源的巨噬細胞RAW264.7和結腸癌細胞Caco-2，采用慶大霉素保護法對野生型菌和突變菌進行細胞實驗。實驗結

7、果顯示，敲除Cas9基因后，對粘附力和侵襲力并沒有顯著性差異，但對細胞內的生存能力具有顯著性差異，表現(xiàn)出減弱的趨勢。
　　采用MTT實驗方法來測定細菌的毒力產生能力，通過測定細菌的產毒能力，來檢測細菌的致病性。實驗結果顯示，兩者之間有顯著的差異性且野生菌比突變菌的產毒能力強，說明敲除Cas9基因后，細菌的產毒能力下降。
　　本實驗采用第二代測序技術(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illu

8、mina NextSeq500測序平臺，對構建的文庫進行雙末端(Paired-end，PE)測序。RNA-Seq的主要目的是檢測敲除Cas9基因后，有哪些毒力基因會發(fā)生變化，從而找出Cas9基因與這些毒力基因的關系。
　　總得來說，表型結果顯示，△Cas9突變體與野生型菌相比，在遷移力、生物膜的形成能力、細胞內的生存能力以及產毒能力這四個方面均表現(xiàn)出減弱。毒力基因型方面，RNA-Seq結果顯示，所有的差異基因中，只有被敲除的Cas