Ca2+介導(dǎo)紅景天苷誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞定向分化的機(jī)制研究.pdf

1、目的：研究紅景天苷誘導(dǎo)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的過程中，Ca2+信號相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)情況，探討紅景天苷誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞定向分化的作用及分子機(jī)制，為BMSCs用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路和方法，為中醫(yī)“腎生髓”理論提供分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：培養(yǎng)小鼠BMSCs系D1細(xì)胞至80％融合，將細(xì)胞分為對照組和紅景天苷誘

2、導(dǎo)組，對照組采用D/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，誘導(dǎo)組使用100mg·L-1紅景天苷分別作用細(xì)胞12，24，48和72h：①M(fèi)TT法檢測D1細(xì)胞誘導(dǎo)前后的增殖率；②免疫熒光染色法標(biāo)記細(xì)胞骨架蛋白β-Tubulin，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；③熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測誘導(dǎo)前后各組細(xì)胞神經(jīng)元標(biāo)志分子神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Neuron-specific enolase，NSE）、微管相關(guān)蛋白2（Microtubule associated prot

3、ein2，MAP2）和β-TubulinⅢ（β-微管蛋白Ⅲ）的表達(dá)。
　　將D1細(xì)胞分為對照組和誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)1組使用不同濃度紅景天苷(5，10，20，50和100 mg·L-1)分別誘導(dǎo)細(xì)胞24h，誘導(dǎo)2組使用100mg·L-1紅景天苷分別誘導(dǎo)D1細(xì)胞12，24，48和72h：①Western blot方法檢測誘導(dǎo)前后MAP2蛋白的表達(dá)情況；②使用Ca2+染色劑Fluo-3/AM負(fù)載細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的變化；③Wes

4、tern blot方法檢測Ca2+/CaM信號通路中關(guān)鍵分子鈣調(diào)蛋白（ Calmodulin， CaM）、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）蛋白表達(dá)水平。
　　使用Ca2+信號特異性阻斷劑：乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸[（ Ethylene Glycol-bis-(β-Aminoethyl)–N，N，N，N-Tetraacetic Acid，EGT

5、A]、硝苯地平（Nifedipine）和PI3K抑制劑（LY294002），按不同方法作用D1細(xì)胞24h，采用Western blot方法檢測不同阻斷劑作用細(xì)胞前后CaM和NSE蛋白的表達(dá)。
　　紅景天苷分別作用D1細(xì)胞12，24和48h后，運(yùn)用PCR-array技術(shù)檢測誘導(dǎo)前后cAMP/Ca2+信號通路中84個(gè)Ca2+相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，從中篩選出表達(dá)差異較顯著的基因進(jìn)行分析，運(yùn)用Western blot方法對其中上調(diào)基因P

6、tgs-2的蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：
　?。?）細(xì)胞形態(tài)學(xué)染色結(jié)果顯示：空白對照組細(xì)胞呈多角形或紡錘形，紅景天苷誘導(dǎo)D1細(xì)胞24h時(shí)，可見部分細(xì)胞伸出突起，胞體變大；誘導(dǎo)48h時(shí)細(xì)胞具有典型的神經(jīng)細(xì)胞樣特征，突起細(xì)長、胞體變小，部分細(xì)胞突起連接成類似神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。
　?。?）MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：紅景天苷誘導(dǎo)D1細(xì)胞12、24、48和72h后，與空白對照組比較，48、72 h誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖活性降低，差異具有統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明紅景天苷誘導(dǎo)后期可抑制D1細(xì)胞增殖而促進(jìn)其分化。
　?。?）熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：紅景天苷誘導(dǎo)D1細(xì)胞12、24、48和72h后，與空白對照組比較，紅景天苷誘導(dǎo)組NSE、MAP2和β-TubulinⅢ蛋白陽性率顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。
　?。?）激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示：不同濃度紅景天苷誘導(dǎo)BMSCs后，Ca2+熒光強(qiáng)度變化不同，100mg·L-1

8、紅景天苷誘導(dǎo)組與空白對照組BMSCs和其它各誘導(dǎo)組比較顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；同一濃度紅景天苷誘導(dǎo)BMSCs不同時(shí)間后，48h誘導(dǎo)組Ca2+熒光強(qiáng)度較高，與其它各誘導(dǎo)組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　（5）Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對照組比較，隨著紅景天苷誘導(dǎo)劑量的增加MAP2蛋白表達(dá)量逐漸上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，同一質(zhì)量濃度紅景天苷誘導(dǎo)D1細(xì)胞

9、24、48h時(shí)與空白對照組比較MAP2蛋白表達(dá)量顯著升高，說明紅景天苷可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化，且誘導(dǎo)具有劑量和時(shí)間效應(yīng)。不同質(zhì)量濃度紅景天苷作用D1細(xì)胞24 h，與空白對照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞CaM蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。與空白對照組比較5、10、20mg·L-1誘導(dǎo)組CaMKⅡ表達(dá)水平均上調(diào)，差異具具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，100mg·L-1誘導(dǎo)組CaMKⅡ表達(dá)水平顯著

10、下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。100 mg·L-1紅景天苷作用D1細(xì)胞12，24，48和72h，與空白對照組比較，CaM的表達(dá)有差異，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，12，24 h組表達(dá)上調(diào)，48，72 h組表達(dá)下調(diào)；CaMKⅡ蛋白表達(dá)與空白對照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，其中48 h組表達(dá)上調(diào)，異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均下調(diào)，異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0

11、5，P<0.01)。
　?。?）阻斷劑組Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Ca2+阻斷劑作用后，與空白對照組比較，紅景天苷誘導(dǎo)組和各阻斷劑組CaM蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與紅景天苷誘導(dǎo)組相比，CaM蛋白表達(dá)在LY294002加紅景天苷誘導(dǎo)組顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余各阻斷劑組均顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。NSE蛋白表達(dá)與空白對照組相比，紅景天苷誘導(dǎo)組和各阻斷

12、劑組均顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）；與紅景天苷誘導(dǎo)組相比，LY294002加紅景天苷誘導(dǎo)組、三種阻斷劑加紅景天苷誘導(dǎo)組、EGTA誘導(dǎo)組的NSE蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），EGTA加紅景天苷誘導(dǎo)組、LY294002誘導(dǎo)組、三種阻斷劑共同作用組表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）。
　?。?）PCR-Array檢測結(jié)果：紅景天苷分別誘導(dǎo)D1細(xì)胞24、48和7

13、2h后，與空白對照組比較，表達(dá)有差異的基因共有38個(gè)，其中上調(diào)基因23個(gè)，下調(diào)基因15個(gè)，以5倍為差異顯著標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過篩選上調(diào)較顯著的基因有：DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子3（ DNA damage-inducible transcript3，DDIT3）、熱休克蛋白5（Heat shock proteins，HSPA5）、磷酸酶1調(diào)節(jié)亞單位15a（Protein phosphatase1 regulatory subunit15a，Ppp1r1

14、5a）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶（Prostaglandin-endoperoxide synthase2，Ptgs-2）；下調(diào)較顯著基因有：胰高血糖素（Glucagon，Gcg），白細(xì)胞介素-2（Interleukin-2，Il-2），腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF），生長激素抑制素（Somatostatin，Sst）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示：與對照組比較，STAT3蛋白表達(dá)

15、在24、48h時(shí)降低，72h時(shí)升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。Ptgs-2的表達(dá)在72h時(shí)升高，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　?。?）紅景天苷能誘導(dǎo)D1細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞。
　?。?）在誘導(dǎo)D1細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞定向分化的過程中紅景天苷可能與L-型鈣通道阻斷劑作用類似，Ca2+／CaM信號通路在誘導(dǎo)分化過程可能起負(fù)調(diào)控作用。
　　（3）紅景天苷誘導(dǎo)D1細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)