自噬調控對JAK2 V617F陽性HEL細胞及真性紅細胞增多癥患者造血細胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　通過檢測JAK2 V617F陽性HEL細胞及真性紅細胞增多癥（PV）患者造血細胞自噬水平，探索自噬調控對HEL細胞及PV患者造血細胞增殖的影響。
　　方法:
　　1.檢測JAK2 V617F陽性HEL細胞自噬活性：應用流式細胞術及吖啶橙（AO）染色法檢測HEL細胞內LC3-蛋白的表達，以JAK2 V617F陰性K562細胞為對照；
　　2.誘導或抑制JAK2 V617F陽性HEL細胞自噬后檢測細胞內L

2、C3-Π蛋白的表達：自噬誘導劑雷帕霉素（終濃度為10μmol/L）和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（終濃度10mmol/L）分別作用于HEL細胞48h后，流式細胞術和吖啶橙（AO）染色法檢測HEL細胞內LC3-Π蛋白的表達。
　　3.誘導或抑制JAK2 V617F陽性HEL細胞自噬活性后CellTiter-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力：自噬誘導劑雷帕霉素（終濃度為10μmol/L）和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（終濃度10mmol/L）

3、分別作用于HEL細胞0h、12h、24h、48h后，CellTiter-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力。
　　4.檢測JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞自噬活性：采集12例臨床上確診的JAK2 V617F陽性PV患者外周血，以15例健康體檢者外周血為對照，流式細胞術和Western blot法檢測JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達。
　　5.誘導或抑制自噬后檢測JAK2 V617F陽性

4、PV患者骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達：自噬誘導劑雷帕霉素（終濃度為10μmol/L）和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（終濃度10mmol/L）分別作用于JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞48h后，流式細胞術和Western blot法檢測細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達。
　　6.誘導或抑制JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞自噬活性后CellTiter-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力：自噬誘導劑雷帕霉素（終濃度為10μmol/

5、L）和自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（終濃度10mmol/L）分別作用于JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞0h、12h、24h、48h后，CellTiter-Glo○R發(fā)光法檢測細胞增殖活力。
　　結果:
　　1.LC3-Ⅱ蛋白在HEL細胞內的表達水平流式細胞術檢測HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白的平均熒光強度值明顯高于 JAK2 V617F陰性 K562細胞，分別為（159388.67±29001.10）、（96046.67±2

6、4134.08）（P﹤0.05）；AO染色熒光顯微鏡觀察HEL細胞內自噬體形成明顯高于K562細胞。
　　2.自噬活性改變后JAK2 V617F陽性HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達流式細胞術檢測結果顯示對照組、雷帕霉素處理組、3-甲基腺嘌呤處理組三組細胞內LC3-II蛋白的平均熒光強度值分別為（95533.33±4273.56）、（268333.30±33560.89）、（20000.00±7285.60）（P﹤0.05）。

7、　　3.自噬活性改變對JAK2 V617F陽性HEL細胞增殖活力的影響 HEL細胞常規(guī)培養(yǎng)，于12h、24h、48h各時間點檢測細胞活力，細胞呈增殖狀態(tài)；自噬誘導劑雷帕霉素作用于HEL細胞12h、24h、48h后，各時間點檢測細胞增殖活力較對照組對應各時間點明顯增強（P﹤0.05）；而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤作用于HEL細胞，于12h、24h、48h各時間點觀察細胞增殖活力較對照組對應各時間點明顯降低（P﹤0.05），48h時雷帕霉素處

8、理組（101413.00±3720.54）、3-MA處理組（5732.00±165.64）細胞增殖活力與對照組（29435.33±971.84）比較差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。
　　4.JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞內LC3-Ⅱ蛋白的表達流式細胞術檢測12例PV患者外周血中髓系細胞內LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強度值明顯高于15例健康體檢者外周血髓系細胞，分別為（92841.67±4249.59）、（86633.33±

9、2503.90）（P﹤0.05）；Western blot檢測3例PV患者外周血細胞內LC3-II蛋白表達高于健康體檢者。
　　5.誘導或抑制自噬對JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達的影響流式細胞術檢測結果顯示，對照組、雷帕霉素處理組、3-甲基腺嘌呤處理組三組髓系細胞內 LC3-Ⅱ蛋白平均熒光強度值分別為（75433.33±10920.78）、（98000.00±2475.88）、（48733.33±69

10、78.78），三組差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）；Western blot檢測結果顯示，3-MA處理組骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達較對照組明顯降低；雷帕霉素處理組骨髓細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達較對照組升高。
　　6.自噬活性改變對JAK2 V617F陽性PV患者骨髓細胞增殖活力的影響 PV患者骨髓細胞常規(guī)培養(yǎng)，隨培養(yǎng)時間延長呈增殖趨勢，應用雷帕霉素和3-MA分別誘導和抑制自噬，于0h、12h、24h、48h各時間點觀察細胞增殖活

11、力，結果顯示，雷帕霉素和3-MA對PV患者骨髓細胞分別有促進和抑制細胞增殖的作用,與對照組對應各時間點比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05），48h時對照組、雷帕霉素處理組、3-MA處理組細胞增殖活力分別為（16200.33±680.00）、（18743.67±1015.09）、（5371.00±55.87），差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0.05）。
　　結論:
　　1.JAK2 V617F陽性HEL細胞和PV患者造血細胞存在較

12、高的基礎自噬水平：JAK2 V617F陽性HEL細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達較JAK2 V617F陰性K562細胞明顯增加；JAK2 V617F陽性PV患者外周血細胞內LC3-Ⅱ蛋白表達表達明顯高于健康體檢者外周血細胞。
　　2.上調自噬活性可促進JAK2 V617F陽性HEL細胞和PV患者骨髓細胞的增殖；下調自噬活性對JAK2 V617F陽性 HEL細胞和PV患者骨髓細胞的增殖有明顯抑制作用。
　　3.自噬異常是真性紅細胞增多