人表皮細(xì)胞對(duì)胰酶耐受及黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)研究.pdf

1、目的：觀察人表皮細(xì)胞對(duì)胰酶消化的耐受能力，探索分離和純化表皮細(xì)胞的新方法，探討胰酶耐受細(xì)胞的干性表達(dá)。并在原代細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，探索角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte,KC)對(duì)黑素小體(Melanosome,MS)的吞噬，同時(shí)驗(yàn)證煙酰胺對(duì)吞噬的抑制作用。
　　方法：
　　(1)中性蛋白酶及胰酶消化獲取表皮細(xì)胞，用0.25％的胰酶懸浮表皮細(xì)胞，以3.0×105/ml的細(xì)胞密度種植于12孔板，每間隔半小時(shí)或1小時(shí)終止胰酶1孔

2、，其中胰酶作用時(shí)間最長(zhǎng)達(dá)46小時(shí)，同樣地胰酶處理培養(yǎng)過(guò)的表皮細(xì)胞，記錄不同細(xì)胞貼壁時(shí)間、生長(zhǎng)狀態(tài)，并在接種后第7天，對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行Nestin、Sox10抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
　　(2)從人毛發(fā)中提取的黑素小體經(jīng)透射電鏡檢測(cè)后，加到人原代角質(zhì)形成細(xì)胞中，觀察黑素小體是否被吞噬，用HMB-45抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)。同時(shí)利用Millicell建立了黑素細(xì)胞(Melanocyte,MC)和角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)模型，用HMB-45熒光

3、抗體標(biāo)記角質(zhì)形成細(xì)胞吞噬的黑素小體，并分別加煙酰胺進(jìn)行干預(yù)。
　　結(jié)果：
　　(1)隨著胰酶作用時(shí)間的延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞數(shù)目遞減，細(xì)胞貼壁所用時(shí)間也延長(zhǎng)。所有孔中最早出現(xiàn)的貼壁細(xì)胞為樹突狀細(xì)胞，這些細(xì)胞開始生長(zhǎng)緩慢，大約4天后生長(zhǎng)迅速，10天后部分孔出現(xiàn)魚群樣細(xì)胞團(tuán)。培養(yǎng)過(guò)的表皮細(xì)胞胰酶消化后結(jié)果和原代細(xì)胞類似，但不出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)。部分孔經(jīng) Nestin、SOX10抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果均為陽(yáng)性，其中以Nestin抗體較明顯。<

4、br>　　(2)角質(zhì)形成細(xì)胞能吞噬從人毛發(fā)中提取的黑素小體，在共培養(yǎng)模型中，黑素細(xì)胞產(chǎn)生的黑素小體可以通過(guò)孔徑為8微米的孔膜，并被其下的角質(zhì)形成細(xì)胞所吞噬，兩者均驗(yàn)證了煙酰胺抑制吞噬作用。
　　結(jié)論：
　　(1)人表皮細(xì)胞對(duì)胰酶消化的耐受能達(dá)46小時(shí)，中和后，黑素細(xì)胞貼壁早于角質(zhì)形成細(xì)胞，貼壁后大多數(shù)細(xì)胞增殖力強(qiáng)，干細(xì)胞表面標(biāo)記顯示陽(yáng)性。
　　(2)角質(zhì)形成細(xì)胞可以吞噬從毛發(fā)中提取的黑素小體，Millicell共培養(yǎng)模