轉(zhuǎn)移因子的提取及聚肌胞的體外降解研究.pdf

1、轉(zhuǎn)移因子(TransferFactor，TF)，是由免疫細(xì)胞產(chǎn)生可以將免疫信息轉(zhuǎn)移到其它個(gè)體的一類多肽與核酸的混合物。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)透析液中多肽和核糖核酸含量的測(cè)定，比較了反復(fù)凍融法和細(xì)胞裂解液處理法這兩種方法對(duì)轉(zhuǎn)移因子提取效果的差異，并進(jìn)一步討論了凍融法中不同解凍方式和凍融次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)移因子收率的影響。在用細(xì)胞裂解液處理脾臟淋巴細(xì)胞時(shí)，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)的方法確定了Tris的基本濃度，同時(shí)比較了不同SDS濃度裂解液對(duì)細(xì)胞破碎效果的差異。
　

2、　 聚肌胞(polyinosinic-polycytidylic，polyI:C)是由聚肌苷酸和聚胞苷酸通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成的雙鏈RNA，是一種高效的干擾素誘導(dǎo)劑。本研究首次用基于SYBRGreenⅠ熒光染料與雙鏈RNA(dsRNA)結(jié)合產(chǎn)生熒光，加熱使雙鏈解開引起熒光減弱的原理，建立一種對(duì)特定雙鏈聚肌胞含量檢測(cè)的方法。同時(shí)通過(guò)對(duì)聚肌胞在兔血清和雞血清中的降解的檢測(cè)，初步了解聚肌胞在這兩種動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的降解情況?，F(xiàn)研究結(jié)果如下:

3、　　 1.脾臟組織用去注射水勻漿比用生理鹽水勻漿的效果更好，表明注射水與脾臟細(xì)胞膜之間形成的滲透壓差更容易破碎細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物釋放出來(lái);反復(fù)凍融6次時(shí)的轉(zhuǎn)移因子中多肽濃度和核酸含量最高，過(guò)多的凍融次數(shù)反而會(huì)使轉(zhuǎn)移因子中的多肽和核酸的含量變少，這可能是過(guò)多的反復(fù)解凍會(huì)對(duì)多肽和核酸產(chǎn)生破壞，致使其含量降低;同時(shí)，也會(huì)使細(xì)胞內(nèi)溶酶體裂解，釋放出水解酶，水解了轉(zhuǎn)移因子中的多肽物質(zhì)。上清液透析24小時(shí)轉(zhuǎn)移因子的的率最高。同樣的，透析時(shí)間延長(zhǎng)并

4、不能使透析液中的轉(zhuǎn)移因子的含量增加，反而會(huì)減少。在化學(xué)破碎法提取轉(zhuǎn)移因子時(shí)，先通過(guò)鏡檢細(xì)胞計(jì)數(shù)確定化學(xué)裂解液的初步配方。確定Tris含量為2.5％時(shí)細(xì)胞破碎率更高。通過(guò)不同濃度SDS的用量，不同透析時(shí)間的選擇，發(fā)現(xiàn)SDS含量為0.7％，透析24小時(shí)的轉(zhuǎn)移因子的含量最高。這兩種方法為工業(yè)提取轉(zhuǎn)移因子提供了工藝參考基礎(chǔ)。
　　 2.通過(guò)用SYBRGreenⅠ熒光染料與聚肌胞結(jié)合，用熒光定量PCR測(cè)定其融解曲線，發(fā)現(xiàn)聚肌胞濃度在0.0

5、25mg/ml～2mg/ml之間線性關(guān)系良好，由于融解曲線能特定反映的是雙鏈核酸的解鏈溫度時(shí)的熒光量和完全解鏈后的熒光量的差值與溫度的變化，故此方法能特定檢測(cè)dsRNA或dsDNA，特異性較高，解決了以前熒光法、紫外分光法和定磷法等的特異性差的缺點(diǎn);實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同動(dòng)物血清中RNA酶活性對(duì)聚肌胞的降解作用有差異，其中，雞血清對(duì)聚肌胞的降解最明顯，而兔血清對(duì)聚肌胞降解稍差。雞血清在加入聚肌胞以后4小時(shí)和24小時(shí)的熒光量幾乎沒(méi)有變化，一直比較低