外泌體介導(dǎo)的miR-222及其衍生物在乳腺癌耐藥中的研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌化療耐藥是乳腺癌（尤其晚期乳腺癌）患者治療失敗最常見和最難克服的問題之一，也是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要原因。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)miR-222能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，同時miR-222水平在阿霉素耐藥的乳腺癌細(xì)胞株(MCF/ADR)的外泌體中明顯升高，但是其通過外泌體傳遞耐藥的機(jī)制并未完全闡明。因此，本課題通過裝載miR-222的衍生物(mimic/inhibitor)進(jìn)入外泌體，建立特殊的外泌體-mimic/

2、inhibitor復(fù)合體模型，探討外泌體中miR-222對乳腺癌耐藥的作用及其潛在機(jī)制。
　　方法:
　　1、以MCF/7細(xì)胞系構(gòu)建出的耐藥株MCF-7/ADR和同步非加藥培養(yǎng)的敏感株MCF-7/S為研究對象。免疫熒光驗證耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞的P糖蛋白和TSG101蛋白的表達(dá)水平，同時蛋白定量精確測定耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞分泌的外泌體量差。
　　2、使用共聚焦顯微觀察攝取不同量（50μg、100μg、200μg）耐藥細(xì)胞外泌

3、體(A-exos)的敏感細(xì)胞;qRT-PCR法檢測各組細(xì)胞中miR-222的水平;用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組經(jīng)外泌體處理后的細(xì)胞與阿霉素共培養(yǎng)后的凋亡率。
　　3、建立電轉(zhuǎn)方程，以最佳條件將miR-222 mimic導(dǎo)入HBL-100外泌體(mimic-exos);研究mimic-exos對敏感細(xì)胞耐藥性的影響。
　　4、通過電轉(zhuǎn)染將miR-222 inhibitor導(dǎo)入外泌體(inhibitor-exos)，耐藥細(xì)胞與inhib

4、itor-exos共培養(yǎng)后，檢測各組細(xì)胞miR-222和PTEN的表達(dá)變化以及相應(yīng)細(xì)胞耐藥性的變化;Western blot和免疫熒光實驗驗證PTEN的蛋白表達(dá)。
　　5、通過比較腫瘤的生長曲線，在荷瘤小鼠體內(nèi)驗證瘤內(nèi)注射inhibitor-exos對腫瘤耐藥細(xì)胞的作用，并檢測腫瘤組織以及小鼠血清外泌體中miR-222和PTEN的表達(dá)變化。
　　6、在新輔助化療后的乳腺癌患者腫瘤標(biāo)本中通過免疫組化染色方法驗證了PTEN及外泌

5、體標(biāo)記蛋白TSG101的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.耐藥細(xì)胞和敏感細(xì)胞P糖蛋白和TSG101蛋白的表達(dá)明顯上調(diào);相同體積的細(xì)胞上清中，耐藥株MCF-7/ADR分泌的外泌體(A-exos)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于敏感株MCF-7/S所分泌的外泌體(S-exos)。
　　2.加入的外泌體量越多，細(xì)胞攝取的量也越多;攝取了更多外泌體(100μg、200μg)的敏感細(xì)胞耐藥性要明顯高于攝取少量外泌體(50μg)的敏感細(xì)胞;攝取了更多耐藥細(xì)胞外

6、泌體的細(xì)胞中miR-222水平明顯高于其他組的細(xì)胞。
　　3.最佳電轉(zhuǎn)染條件:50μg/100μL外泌體，轉(zhuǎn)染時電壓180V;成功構(gòu)建mimic-exos復(fù)合體，與敏感細(xì)胞共培養(yǎng)后可明顯增強(qiáng)其對阿霉素的耐藥性。
　　4.加入inhibitor-exos共培養(yǎng)的耐藥細(xì)胞的對阿霉素的耐藥性減低，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率明顯增加;且伴隨細(xì)胞中miR-222水平下調(diào)和PTEN的表達(dá)增強(qiáng)。
　　5.瘤內(nèi)注射inhibitor-e

7、xos的小鼠腫瘤大小明顯小于對照和空白組，腫瘤組織中的miR-222水平下調(diào)，且靶基因PTEN的表達(dá)增強(qiáng)。
　　6.檢測接受新輔助化療的乳腺癌患者腫瘤組織，發(fā)現(xiàn)PTEN在耐藥組中低表達(dá)，外泌體標(biāo)記蛋白TSG101在耐藥組中高表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.耐藥細(xì)胞比敏感細(xì)胞分泌更多的外泌體。
　　2.耐藥細(xì)胞的外泌體能夠通過傳遞miR-222增強(qiáng)敏感細(xì)胞的耐藥性。
　　3.構(gòu)建的mimic-exos復(fù)合體和in