FoxO1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞IL-1β誘導(dǎo)的自刺激中的作用及其機(jī)制.pdf

1、背景與目的:
　　糖尿病視網(wǎng)膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的微血管并發(fā)癥，也被認(rèn)為是一種慢性低度炎癥性疾病。在糖尿病的早期階段，DR的特征是視網(wǎng)膜屏障（the blood-retinal barrier，BRB）的破壞，而組成內(nèi)層視網(wǎng)膜屏障的主要部分是內(nèi)皮細(xì)胞，并且隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，內(nèi)皮細(xì)胞死亡數(shù)目增加。除內(nèi)皮細(xì)胞死亡外，炎癥介質(zhì)也會(huì)通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)增加血管通透性。炎癥因子白介素-1β（In

2、terleukin-1β, IL-1β）的水平在糖尿病患者和動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜、玻璃體和血清中升高，還能以旁分泌和自分泌的方式誘導(dǎo)自身的合成，加速并擴(kuò)大糖尿病視網(wǎng)膜中的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1（Forkhead transcription factor, FoxO1）是叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O亞家族中重要的一員，在調(diào)控增殖凋亡、氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)自噬和分化等方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在1型和2型糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜中，F(xiàn)oxO1的活性增加

3、，并伴隨著炎癥反應(yīng)和凋亡增加。因此推測(cè)DR狀態(tài)下FoxO1活性增加可能與炎癥有一定的聯(lián)系，但FoxO1調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能的具體機(jī)制尚不清楚。
　　研究發(fā)現(xiàn)，在原代大鼠肝細(xì)胞和 HEK293細(xì)胞中，IL-1β通過(guò)刺激 IL-1受體過(guò)表達(dá)導(dǎo)致胞質(zhì)和核內(nèi)FoxO1蛋白量增加。而在巨噬細(xì)胞中，F(xiàn)oxO1直接結(jié)合到IL-1β啟動(dòng)子上，促進(jìn)IL-1β的表達(dá)增加。因此推測(cè)，IL-1β在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中可刺激FoxO1表達(dá)增加，從而促進(jìn)IL-1β的

4、表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)以FoxO1特異性小干擾RNA（siRNA）慢病毒載體下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞和STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的FoxO1的表達(dá)及活性，觀察FoxO1在IL-1β誘導(dǎo)的自刺激中的作用，并探討其機(jī)制。
　　方法:
　　原代人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞（HRMECs）培養(yǎng)于不同糖濃度（5.6、15、25、35mmol/L）24h后，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）和Western blotting法檢測(cè)FoxO1、I

5、L-1β的表達(dá)。HRMECs培養(yǎng)于重組人白介素-1β(rIL-1β)的不同濃度（0、1、2.5、10、25、100ng/mL）24h后，Real-time PCR、Western blotting檢測(cè)處理后細(xì)胞的FoxO1、IL-1β、Caspase-8表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)處理后細(xì)胞中FoxO1的表達(dá)分布，流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度rIL-1β處理后HRMECs的凋亡率。HRMECs培養(yǎng)于IL-1受體阻斷劑（IL-1RA）、MAPK阻斷劑

6、（U0126、SB203580、SP600125）中伴或不伴 rIL-1β（10ng/mL）,Western blotting法檢測(cè)FoxO1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表達(dá)。將構(gòu)建的 FoxO1特異性小干擾 RNA（siRNA）慢病毒載體及空慢病毒載體（LV-NC）轉(zhuǎn)染于正常培養(yǎng)的HRMECs，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞經(jīng)或不經(jīng)過(guò)rIL-1β（10ng/mL）刺激24h后，Real-time PCR、Western blotting法檢測(cè)

7、FoxO1、IL-1β的表達(dá)。
　　40只 SPF級(jí)雄性 SD大鼠，隨機(jī)選取其中30只構(gòu)建糖尿病大鼠模型，10只作為正常對(duì)照組（NC組）。糖尿病造模成功后，將成模糖尿病大鼠隨機(jī)分為3組：糖尿病組（DM組），糖尿病FoxO1干擾轉(zhuǎn)染組（LV-si-FoxO1組）和糖尿病空病毒轉(zhuǎn)染組（LV-NC組）。大鼠麻醉后，在解剖顯微鏡下玻璃體注射FoxO1特異性小干擾RNA（siRNA）慢病毒載體及空慢病毒載體（LV-NC）10μl，涂抹抗生素

8、軟膏以保護(hù)角膜。于病毒注射后4周、8周、12周末，稱(chēng)體重（Body Weight, BW），尾靜脈取血測(cè)血糖。12周末水合氯醛麻醉大鼠，迅速剝離出眼球，置于4％多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫組化檢查，于4%預(yù)冷戊二醛固定用于電子顯微鏡檢查。新鮮眼球，去除眼前節(jié)，分離出視網(wǎng)膜，迅速于液氮中冷凍，熒光定量PCR和Western bloting檢測(cè)FoxO1、IL-1β表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.高糖誘導(dǎo)HRMECs的FoxO1

9、和IL-1β表達(dá)增加：FoxO1和IL-1β蛋白和 mRNA的表達(dá)水平隨著葡萄糖濃度的增加而增加,特別是糖濃度在35mmol/L時(shí)候顯著升高（P＜0.05）。
　　2. rIL-1β誘導(dǎo) HRMECs的早期凋亡是濃度依賴(lài)性，但并不依賴(lài) Caspase-8的表達(dá)：正常培養(yǎng)的HRMECs早期凋亡率是0.5%，而培養(yǎng)于不同濃度（1、2.5、10、25、100ng/mL）的rIL-1β后，凋亡率分別增加為5.3%，6.6%，8.1%，8.

10、3%，12.6%。不同濃度的rIL-1β對(duì)HRMECs的Caspase-8蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯影響（P＞0.05）。
　　3.不同濃度rIL-1β誘導(dǎo)HRMECs的FoxO1和IL-1β表達(dá)增加：與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1和IL-1β mRNA及蛋白的表達(dá)水平隨著rIL-1β濃度的增加而明顯增加（均P＜0.05）；細(xì)胞免疫熒光化學(xué)提示隨著rIL-1β濃度的增加，F(xiàn)oxO1在細(xì)胞核內(nèi)和胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)增加，在rIL-1β濃度為25和100n

11、g/mL時(shí)，表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。
　　4.IL-1受體阻斷劑（IL-1RA）、MAPK阻斷劑（U0126、SB203580、SP600125）減少rIL-1β誘導(dǎo)HRMECs的FoxO1表達(dá)：IL-1RA可減少rIL-1β誘導(dǎo)HRMECs的FoxO1和IL-1β表達(dá)。 rIL-1β可激活細(xì)胞的磷酸化MAPK（p-ERK、p-P38、p-JNK），而 IL-1RA可以阻斷rIL-1β誘導(dǎo)的MAPK的磷酸化。另外，MAPK阻

12、斷劑也可抑制rIL-1β誘導(dǎo)的FoxO1蛋白表達(dá)。
　　5. LV si-FoxO1慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，rIL-1β誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的FoxO1和IL-1β表達(dá)減弱：HRMECs為原代細(xì)胞，流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染組和空載組的轉(zhuǎn)染效率分別是68.1%和58.5%。與正常組相比，IL-1β組和LV-NC+IL-1β組FoxO1和IL-1β表達(dá)都明顯增加（P＜0.001）；與10ng/ml rIL-1β組相比，rIL-1β+LV si-FoxO1組Fo

13、xO1的mRNA表達(dá)水平降低，但仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而rIL-1β+LV si-FoxO1組IL-1β的mRNA水平則顯著降低（P＜0.001）
　　6.在大鼠視網(wǎng)膜中，慢病毒轉(zhuǎn)染可下調(diào)FoxO1和IL-1β表達(dá)：與NC組相比，DM組 FoxO1和 IL-1β蛋白和 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，而LV-si-FoxO1組FoxO1和IL-1β表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，DM組Fox

14、O1和IL-1β免疫染色較NC組顯著增加，LV-si-FoxO1組免疫染色則不顯著，F(xiàn)oxO1免疫染色主要分布外網(wǎng)狀層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，IL-1β免疫染色在視網(wǎng)膜全層表達(dá)增加。電鏡結(jié)果顯示正常組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體形態(tài)正常，官腔未變形。DM組和LV-NC組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體明顯腫脹，可見(jiàn)空泡變性，管腔明顯狹窄。LV-si-FoxO1組內(nèi)皮細(xì)胞線粒體輕度腫脹，官腔未見(jiàn)明顯變形。
　　結(jié)論:
　　1.在HRMECs中 IL