中國一先天性無虹膜家系基因突變位點(diǎn)的測(cè)序及遺傳分析.pdf

1、背景與目的
　　先天性無虹膜是一種世界范圍內(nèi)罕見的雙眼發(fā)病可累及全眼多個(gè)組織結(jié)構(gòu)的遺傳疾病，遺傳方式通常為常染色體顯性遺傳(autosomal dominant)，全球人群發(fā)病率約1/40000-1/100000，其中約2/3為家族性、1/3呈散發(fā)。經(jīng)典的先天性無虹膜癥為單純的眼部病變，主要表現(xiàn)為雙側(cè)眼的虹膜部分或完全缺失，可伴有包括角膜、前房、晶狀體、視網(wǎng)膜和視神經(jīng)等在內(nèi)的部分或全部眼組織發(fā)育異常或功能障礙。而上述先天性無虹膜表

2、現(xiàn)可作為并發(fā)癥可伴發(fā)于WAGR綜合癥（約13％）和極為罕見的Gillespie綜合征（常染色體隱性遺傳，約占2%）。遺傳學(xué)研究表明，PAX6基因變異可解釋90%的先天性無虹膜的發(fā)生，隨著近年來第二代測(cè)序技術(shù)的普及和前房角發(fā)育相關(guān)基因研究的深入，ABCB6、FOXC1、PITX2、等多個(gè)基因的變異被報(bào)道發(fā)現(xiàn)于先天性無虹膜患者的基因序列中，且有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立了相關(guān)模型證實(shí)了部分基因變異可導(dǎo)致虹膜發(fā)育異常。本研究旨于利用第二代測(cè)序技術(shù)聯(lián)合目標(biāo)基

3、因定點(diǎn)捕獲技術(shù)篩查中國漢族一先天性無虹膜家系致病突變位點(diǎn)并通過家系驗(yàn)證和遺傳分析探索其與疾病的關(guān)聯(lián)。
　　資料與方法
　　采集2016年3月就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼二科一中國漢族先天性無虹膜家系，3代共9名成員，其中Ⅰ代1號(hào)已故（原因不明，排除無虹膜及相關(guān)系統(tǒng)性疾病病史），在世8名成員中3名患者、5名表型正常者。另召集100名無三代以內(nèi)直系及旁系親緣關(guān)系且無眼部及全身系統(tǒng)性基礎(chǔ)疾病的志愿者作為正常對(duì)照。本研究嚴(yán)格遵守赫爾

4、基新宣言，經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(2016年科研第51號(hào))，所有參與實(shí)驗(yàn)的成年人（滿18歲）及未成年人（未滿18歲）監(jiān)護(hù)人均閱讀并簽署參與實(shí)驗(yàn)知情同意書。
　　使用Tiangen DNA提取試劑盒提取家系成員及對(duì)照組血液樣本中的基因組DNA，根據(jù)已知文獻(xiàn)報(bào)道的無虹膜相關(guān)基因定制目標(biāo)序列捕獲測(cè)序Panel，利用二代測(cè)序結(jié)合定點(diǎn)捕獲技術(shù)對(duì)先證者基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測(cè)序，通過結(jié)果分析處理與基因庫進(jìn)行對(duì)比篩選出含有

5、可疑突變的候選基因。
　　根據(jù)上下游序列針對(duì)篩查后鎖定的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，對(duì)全體家系成員行DNA定向PCR擴(kuò)增后應(yīng)用Sanger法進(jìn)行家系驗(yàn)證，最終確定該家系的致病位點(diǎn)。
　　結(jié)果
　　本家系先天性無虹膜遺傳模式符合常染色體顯性遺傳，患者均為雙眼發(fā)病，共同的眼部異常表現(xiàn)為：雙眼低視力（矯正無提高），高眼壓，虹膜缺如，角膜緣不規(guī)則增厚、基質(zhì)渾濁，眼球水平震顫，中心凹發(fā)育不良；不同患者特異性眼部表現(xiàn)分別為：Ⅱ-2患左眼上瞼

6、下垂，右眼先天性白內(nèi)障，Ⅲ-2患雙眼先天性白內(nèi)障，雙側(cè)晶狀體向上不全脫位。
　　分析目標(biāo)序列定點(diǎn)捕獲測(cè)序結(jié)果，經(jīng)基因庫對(duì)比后發(fā)現(xiàn)先證者目標(biāo)基因擁有13個(gè)可疑突變位點(diǎn)，通過有害分析預(yù)測(cè)篩選出PAX6基因第6號(hào)外顯子上堿基替換c.183C>A唯一與疾病高度相關(guān)聯(lián)，Sanger測(cè)序驗(yàn)證該家系中所有患者均含有此突變，該突變屬無義突變，導(dǎo)致DNA轉(zhuǎn)錄翻譯提前終止，與此同時(shí)家系表型正常者及健康對(duì)照者均不存在此突變。
　　查閱NCBI s

7、np、dbsnp、1000genomes數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)此突變對(duì)應(yīng)堿基替換人群發(fā)生率極低，不屬于snp，曾被一例西方文獻(xiàn)報(bào)道為散發(fā)突變但未有臨床資料證實(shí)。
　　結(jié)論
　　1.通過對(duì)先證者的目的基因二代測(cè)序篩選出該無虹膜家系的致病基因位點(diǎn)（PAX6基因c.183C>A, p.Y61X）,該堿基替換導(dǎo)致無義突變，DNA轉(zhuǎn)錄翻譯提前終止(PTC)，雜合突變致使PAX6基因表達(dá)單倍劑量不足，Sanger測(cè)序家系內(nèi)驗(yàn)證該突變與表型共分離，且