中國多中心連續(xù)五年侵襲性感染熱帶念珠菌流行病學及唑類耐藥機制研究.pdf

1、目的：熱帶念珠菌是臨床侵襲性真菌感染的重要病原菌，病死率高。在中國，其對唑類藥物的耐藥性已經引起了廣泛關注。本研究對中國侵襲性感染熱帶念珠菌的體外藥物敏感性變遷、分子流行病學特征及對唑類藥物的耐藥機制進行了系統(tǒng)性的研究。
　　方法：本研究選取了2009年8月至2014年7月連續(xù)五年參加CHIF-NET的十家監(jiān)測中心收集的所有非重復侵襲性感染熱帶念珠菌進行研究，總納入菌株數(shù)507株。在菌株準確鑒定的基礎上，測定菌株9種抗真菌藥物的最

2、小抑菌濃度。同時計算監(jiān)測期內氟康唑、伏立康唑抗菌藥物使用強度。利用本研究新建立的針對熱帶念珠菌的微衛(wèi)星分型體系，對全部507株菌進行分子分型，進而進行聚類及同源性分析。耐藥機制研究方面，對氟康唑耐藥組與敏感組菌株的靶位點基因ERG11及泵蛋白基因MDR1、CDR1以及線粒體細胞色素b基因CYTb進行熒光定量PCR分析，以分析不同表型組別之間基因表達量的差異。此外，對所有507菌株ERG11基因進行擴增測序，篩查堿基突變位點。利用pYES

3、2/CT質粒構建表達載體，對潛在的唑類耐藥錯義突變進行功能驗證。另外，使用三種唑類對1株臨床分離株進行體外誘導耐藥，觀察不同藥物誘導菌株對唑類藥物的MIC值變化，并檢測其耐藥機制。
　　結果：侵襲性熱帶念珠菌感染中，最常見的血流感染，占到53.4％(220/507)。體外抗菌藥物敏感性結果顯示，23.1％和20.7％的菌株對氟康唑及伏立康唑不敏感。同時，有11.4％的菌株呈現(xiàn)氟康唑、伏立康唑交叉耐藥的現(xiàn)象。對于棘白菌素類藥物，99

4、％以上的菌株敏感。唑類藥物非敏感率在監(jiān)測五年期間有顯著增長的趨勢，對氟康唑的非敏感率由11.2％增長至42.7％;對伏立康唑的非敏感率由10.4％增長至39.1％。氟康唑-伏立康唑交叉耐藥的耐藥率也由6.6％上升至21.7％。但是，唑類非敏感率的上升與臨床唑類藥物使用強度沒有相關性。
　　對比分子分型“金標準”脈沖場凝膠電泳，本研究新建的ctm1-ctm3-ctm24三位點微衛(wèi)星分型體系的分辨力能夠達到0.99。507株熱帶念珠菌

5、中，共檢出296個微衛(wèi)星型，其中最常見的基因型為MT178型，占比4.1％?？傮w來講，菌株分子型別散在，并沒有發(fā)現(xiàn)地域聚集現(xiàn)象。但是，結合體外抗真菌藥物敏感性結果發(fā)現(xiàn)，氟康唑非敏感菌株相對集中在四個微衛(wèi)星群中，尤其是Ⅳ群，24株菌全部為氟康唑-伏立康唑交叉耐藥株。
　　綜合分析本研究收集菌株的唑類耐藥機制，ERG11基因的錯義突變是導致唑類耐藥的最主要原因，65株氟康唑耐藥株中，僅有3株未發(fā)現(xiàn)耐藥相關突變。ERG11基因A395T

6、/W&C461T/Y雙突變在氟康唑耐藥菌中檢出頻率最高，能夠占到耐藥菌總數(shù)的76.9％(50/65)。載體構建功能驗證發(fā)現(xiàn)，A395T單突變即可導致菌株唑類MIC值急劇升高，但相反C461T突變對菌株的唑類藥物敏感性并無影響。同時，ERG11基因T374C、T769C、G1390A均會導致菌株唑類MIC值的大幅升高，但A983G突變與耐藥無關。熒光定量PCR結果顯示，氟康唑耐藥組ERG11基因的平均表達水平高于敏感組;耐藥組CYTb基因

7、的表達量低于敏感組。相比，CDR1、MDR1基因平均表達水平不同組間并無明顯差異。
　　結論：中國侵襲性感染相關熱帶念珠菌對氟康唑和伏立康唑呈現(xiàn)高度唑類耐藥性，并且近年來呈現(xiàn)明顯的持續(xù)升高的趨勢，尤其是監(jiān)測后兩年耐藥率急劇升高。臨床分離熱帶念珠菌基因背景整體呈現(xiàn)多態(tài)性，但發(fā)現(xiàn)了與氟康唑非敏感表型相關的克隆群。ERG11基因的錯義突變是引起中國熱帶念珠菌唑類耐藥的最主要原因，絕大多數(shù)的氟康唑耐藥菌是由A395T錯義突變導致。同時，E