TLR4-ROS-miRNA-21途徑在脂多糖促進(jìn)肺癌進(jìn)展中的研究.pdf

1、目的:
　　LPS（Lipopolysaccharide，脂多糖）是革蘭氏陰性桿菌外膜的主要成分之一，能夠直接促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。TLR4能夠識(shí)別革蘭氏陰性桿菌的LPS，TLR4表達(dá)增強(qiáng)預(yù)示肺癌病人病情進(jìn)展。這些發(fā)現(xiàn)表明通過(guò)LPS活化TLR4對(duì)肺癌進(jìn)展至關(guān)重要。然而，肺癌進(jìn)展是否與LPS直接相關(guān)及其相關(guān)機(jī)制尚不明確。
　　MiRs（MicroRNAs，寡核糖核酸）是非編碼小RNA分子，是重要的mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)者，在癌癥進(jìn)展

2、中充當(dāng)了重要而又復(fù)雜的角色。MiRs與多種惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。MiR-21是MiRs一種，是在實(shí)體瘤中最常見(jiàn)表達(dá)的寡核糖核酸，其在惡性腫瘤組織中表達(dá)量與正常組織相比高5～100倍。
　　在這些研究中，描述了LPS在肺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的作用，評(píng)估了MiR-21在其過(guò)程中的意義。證實(shí)在肺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中MiR-21是必須的。肺癌腫瘤細(xì)胞中LPS活化TLR4后，會(huì)引起ROS產(chǎn)生增多，ROS反過(guò)來(lái)又會(huì)引起miR-21表達(dá)上

3、調(diào)。這些研究可進(jìn)一步理解肺癌的發(fā)病機(jī)制，并對(duì)肺癌的治療提出新的治療措施。
　　方法:
　　道德規(guī)范聲明
　　所有病人通過(guò)郵件形式參與研究。臨床樣本研究遵從1964年《赫爾辛基宣言》及其修訂版。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手冊(cè)執(zhí)行。人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也同時(shí)也遵從同濟(jì)機(jī)構(gòu)(Institutiongal)倫理委員會(huì)。
　　病人
　　全部50名肺癌病人轉(zhuǎn)染革蘭氏陰性桿菌入組研究。肺癌均為病理診斷。樣本中有自身免疫疾病或經(jīng)過(guò)免

4、疫治療的排除在外。
　　鼠
　　從上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買(mǎi)6-8周雌性BALB/c裸鼠，所有小鼠均在無(wú)病原體條件下飼養(yǎng)。
　　細(xì)胞培養(yǎng)和試劑
　　人肺癌細(xì)胞取自組織標(biāo)本。將組織標(biāo)本放置于50mL的離心管內(nèi)，離心管內(nèi)加入5～10mLⅠ型膠原酶溶液(Invitrogen)(在LHC培養(yǎng)基中溶解膠原酶Ⅰ，最終濃度為1mg/mL)。在37℃水浴箱中溫浴、振蕩1小時(shí)。將含青/鏈霉素、10％胎牛血清(fet bovine ser

5、um，F(xiàn)BS)的LHC培養(yǎng)基混勻細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板中，放入35％CO、2℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中，每2～3天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并半量換液。LPS購(gòu)自Sigma，psiRNA載體及對(duì)比劑購(gòu)自O(shè)rigene，Mir-21(MI0000077)表達(dá)載體及對(duì)比劑購(gòu)自O(shè)rigene，人miR-21shRNA(shADV-215486)及對(duì)比劑購(gòu)自Vector Biolabs，Tempol購(gòu)自Santa Cruz。所有試劑均規(guī)范使用。
　　體

6、外腫瘤生長(zhǎng)
　　利用MTT比色法分析原代人肺癌細(xì)胞擴(kuò)增表達(dá)觀察體外腫瘤生長(zhǎng)。將96孔培養(yǎng)板每孔中接種4×103個(gè)肺癌細(xì)胞，加入或不加入LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)，培養(yǎng)3天，每天觀察腫瘤生長(zhǎng)。用MTT比色法分析細(xì)胞擴(kuò)增。
　　體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)
　　裸鼠內(nèi)原代肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)如前所述。將4×106個(gè)原代肺癌細(xì)胞懸浮于200ulPBS中，將其注射于裸鼠的皮下。相同劑量的PBS注入對(duì)照組小鼠。在皮下注

7、射前，用LPS(10ug/ml)處理原代肺癌細(xì)胞24小時(shí)，或用PBS作為參照。用數(shù)顯卡尺測(cè)量移植后3、6、9天后的腫瘤體積。每個(gè)腫瘤均被不同人員測(cè)量?jī)纱巍?br>　　R-T PCR檢測(cè)
　　利用QiagenRNeasy mini kit提取總的RNA，利用Maxima First Strand cDNA Synthesisb Kits（Thermo Scientific公司）轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物購(gòu)自Applied Biosyst

8、ems公司，利用Maxima SYBR Green qPCR Master MIXES（美國(guó)Thermo）的試劑定量PCR分析進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)mRNA的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)對(duì)照。TaqMan miRNA assays（Applied Biosystems公司）監(jiān)測(cè)miRNA表達(dá)，U6RNA作為內(nèi)參照。
　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)
　　流量分析，PE共軛抗體人抗TLR4抗體0.5×106個(gè)細(xì)胞染色(12-9917-42，eBioscie

9、nce公司)，或同型對(duì)照（12-4724-81，eBioscience公司），流式細(xì)胞儀分析。用CellROX Deep Red Reagent（Life Technologies公司）檢測(cè)ROS水平。FlowJo軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果:
　　1.LPS促進(jìn)肺癌進(jìn)展
　　為研究LPS在肺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的作用，用不同劑量的LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激肺癌細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)

10、果顯示肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與LPS存在劑量依賴(lài)性。在肺癌細(xì)胞中能快速發(fā)現(xiàn)TLR4。TLR4被LPS刺激后，表達(dá)明顯上調(diào)，與劑量呈正相關(guān)。為研究TLR4、LPS在肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，將肺癌原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染上TLR4shRNA，然后給予LPS刺激調(diào)控。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染上TLR4shRNA的肺癌細(xì)胞，TLR4在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均降低，并阻礙脂多糖誘導(dǎo)肺癌原代細(xì)胞的生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)表明TLR4是LPS誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)鍵受體。
　　為確定在活

11、體上LPS促肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的作用，將肺癌細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)有LPS刺激的肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯高于無(wú)LPS刺激的肺癌細(xì)胞。阻斷TLR4后，就減緩了肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　實(shí)質(zhì)上，這些結(jié)果表明通過(guò)LPS激發(fā)TLR4后可促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　2.LPS促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中需要MiR-21
　　為評(píng)估MiR-21在LPS促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用，觀察MiR-21在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)MiR-21與LPS存在劑量依賴(lài)性。L

12、PS促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，阻斷TLR4后，MiR-21的表達(dá)同樣也出現(xiàn)抑制。當(dāng)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21shRNA后，LPS激活肺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21shRNA的肺癌細(xì)胞表達(dá)降低，并阻斷了LPS誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。
　　為研究miR-21在LPS促進(jìn)肺癌細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)過(guò)程中的潛在作用，將轉(zhuǎn)染miR-21shRNA和預(yù)處理LPS的肺癌細(xì)胞種植于裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示下調(diào)miR-21表達(dá)會(huì)減弱LPS增強(qiáng)肺癌細(xì)胞增長(zhǎng)。這些結(jié)果表明LPS促

13、進(jìn)肺癌細(xì)胞增長(zhǎng)是需要miR-21強(qiáng)化的。
　　3.MiR-21促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)
　　假定MiR-21在LPS誘導(dǎo)腫瘤生長(zhǎng)中的重要作用，發(fā)現(xiàn)了miR-21自身促肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。轉(zhuǎn)染miR-21的肺癌細(xì)胞導(dǎo)致miR-21表達(dá)上調(diào)和腫瘤生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染miR-21shRNA緩解肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。為證實(shí)在體內(nèi)的研究結(jié)果，將轉(zhuǎn)染miR-21及miR-21shRNA的肺癌細(xì)胞分別植入裸鼠內(nèi)，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)增加miR-21表達(dá)增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)，降低mi

14、R-21表達(dá)會(huì)減弱腫瘤生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)認(rèn)為miR-21是肺癌腫瘤生長(zhǎng)的必須致癌miRNA。
　　眾所周知m iR-21作用于磷酸酶基因(PTEN)和程序性細(xì)胞死亡因子(PDCD4)，但是否在肺癌細(xì)胞中miR-21亦作用于PTEN和(PDCD4)。轉(zhuǎn)染miR-21的表達(dá)降低了PTEN和PDCD4的表達(dá)。反之亦然，轉(zhuǎn)染miR-21shRNA使PTEN和PDCD4的表達(dá)上調(diào)。更重要的是，PTEN和PDCD4的過(guò)度表達(dá)會(huì)阻斷肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中m

15、iR-21的致癌作用。這些數(shù)據(jù)表明在肺癌中PTEN和PDCD4是miR-21主要作用目標(biāo)。
　　4.LPS引起miR-21表達(dá)，引起細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加
　　活性氧(ROS)參與TLR4激發(fā)的免疫應(yīng)答和肺癌進(jìn)展。發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平與LPS濃度呈正相關(guān)，LPS濃度愈高，ROS水平亦愈高。結(jié)果表明在肺癌細(xì)胞中LPS促進(jìn)ROS的產(chǎn)生。阻斷TLR4后則阻斷LPS誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。為研究LPS誘導(dǎo)肺癌生長(zhǎng)中ROS的作用，將LPS

16、處理的肺癌細(xì)胞，再用Tempol（4-羥基-2，2，6，6-四甲基哌啶）消除ROS。結(jié)果顯示，Tempol阻斷了LPS誘導(dǎo)肺癌生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)miR-21表達(dá)需要ROS，并發(fā)現(xiàn)Tempol阻斷miR-21與LPS正相關(guān)性。
　　為研究在體內(nèi)LPS誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中ROS的作用，將含或無(wú)Tempol的LPS預(yù)處理的肺癌細(xì)胞注入裸鼠內(nèi)，結(jié)果顯示在體內(nèi)有Tempol的肺癌細(xì)胞抑制了LPS誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)。
　　總之，ROS產(chǎn)生增

17、加是LPS誘導(dǎo)miR-21表達(dá)和腫瘤生長(zhǎng)是至關(guān)重要的。
　　5.在肺癌病人中TLR4表達(dá)與miR-21表達(dá)和ROS產(chǎn)生具有相關(guān)性
　　為證實(shí)在臨床上這些研究結(jié)果，分析了腫瘤組織和正常組織中TLR4和miR-21的表達(dá)。結(jié)果顯示TLR4和miR-21的表達(dá)在腫瘤組織中明顯增高。進(jìn)一步分析，未接受治療的肺癌細(xì)胞TLR4、miR-21的表達(dá)和ROS水平。分析發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)與miR-21表達(dá)和ROS水平存在相關(guān)性。在肺癌細(xì)胞中RO

18、S水平與miR-21表達(dá)具有正相關(guān)性。
　　這些結(jié)果表明在肺癌病人腫瘤進(jìn)展中存在TLR4/ROS/miR-21通路。
　　結(jié)論:
　　在肺癌細(xì)胞中，LPS活化TLR4后導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加，又增加miR-21的表達(dá)和腫瘤增長(zhǎng)。TLR4表達(dá)與miR-21表達(dá)和ROS水平存在緊密相關(guān)性，表明未治療的肺癌細(xì)胞存在TLR4/ROS/miR-21通路。這些結(jié)果揭示了個(gè)新的機(jī)制:革蘭氏陰性桿菌能加速肺癌進(jìn)展，并為治療肺癌病人提供新的