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文檔簡介
1、目的:
LPS(Lipopolysaccharide,脂多糖)是革蘭氏陰性桿菌外膜的主要成分之一,能夠直接促進腫瘤進展。TLR4能夠識別革蘭氏陰性桿菌的LPS,TLR4表達增強預(yù)示肺癌病人病情進展。這些發(fā)現(xiàn)表明通過LPS活化TLR4對肺癌進展至關(guān)重要。然而,肺癌進展是否與LPS直接相關(guān)及其相關(guān)機制尚不明確。
MiRs(MicroRNAs,寡核糖核酸)是非編碼小RNA分子,是重要的mRNA和蛋白表達的調(diào)節(jié)者,在癌癥進展
2、中充當(dāng)了重要而又復(fù)雜的角色。MiRs與多種惡性腫瘤的發(fā)生進展密切相關(guān)。MiR-21是MiRs一種,是在實體瘤中最常見表達的寡核糖核酸,其在惡性腫瘤組織中表達量與正常組織相比高5~100倍。
在這些研究中,描述了LPS在肺癌腫瘤細胞生長過程中的作用,評估了MiR-21在其過程中的意義。證實在肺癌腫瘤細胞生長過程中MiR-21是必須的。肺癌腫瘤細胞中LPS活化TLR4后,會引起ROS產(chǎn)生增多,ROS反過來又會引起miR-21表達上
3、調(diào)。這些研究可進一步理解肺癌的發(fā)病機制,并對肺癌的治療提出新的治療措施。
方法:
道德規(guī)范聲明
所有病人通過郵件形式參與研究。臨床樣本研究遵從1964年《赫爾辛基宣言》及其修訂版。動物實驗按照醫(yī)學(xué)動物實驗手冊執(zhí)行。人和動物實驗也同時也遵從同濟機構(gòu)(Institutiongal)倫理委員會。
病人
全部50名肺癌病人轉(zhuǎn)染革蘭氏陰性桿菌入組研究。肺癌均為病理診斷。樣本中有自身免疫疾病或經(jīng)過免
4、疫治療的排除在外。
鼠
從上海動物實驗中心購買6-8周雌性BALB/c裸鼠,所有小鼠均在無病原體條件下飼養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)和試劑
人肺癌細胞取自組織標(biāo)本。將組織標(biāo)本放置于50mL的離心管內(nèi),離心管內(nèi)加入5~10mLⅠ型膠原酶溶液(Invitrogen)(在LHC培養(yǎng)基中溶解膠原酶Ⅰ,最終濃度為1mg/mL)。在37℃水浴箱中溫浴、振蕩1小時。將含青/鏈霉素、10%胎牛血清(fet bovine ser
5、um,F(xiàn)BS)的LHC培養(yǎng)基混勻細胞接種至24孔培養(yǎng)板中,放入35%CO、2℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中,每2~3天觀察細胞生長狀態(tài),并半量換液。LPS購自Sigma,psiRNA載體及對比劑購自O(shè)rigene,Mir-21(MI0000077)表達載體及對比劑購自O(shè)rigene,人miR-21shRNA(shADV-215486)及對比劑購自Vector Biolabs,Tempol購自Santa Cruz。所有試劑均規(guī)范使用。
體
6、外腫瘤生長
利用MTT比色法分析原代人肺癌細胞擴增表達觀察體外腫瘤生長。將96孔培養(yǎng)板每孔中接種4×103個肺癌細胞,加入或不加入LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml),培養(yǎng)3天,每天觀察腫瘤生長。用MTT比色法分析細胞擴增。
體內(nèi)腫瘤生長
裸鼠內(nèi)原代肺癌細胞生長監(jiān)測如前所述。將4×106個原代肺癌細胞懸浮于200ulPBS中,將其注射于裸鼠的皮下。相同劑量的PBS注入對照組小鼠。在皮下注
7、射前,用LPS(10ug/ml)處理原代肺癌細胞24小時,或用PBS作為參照。用數(shù)顯卡尺測量移植后3、6、9天后的腫瘤體積。每個腫瘤均被不同人員測量兩次。
R-T PCR檢測
利用QiagenRNeasy mini kit提取總的RNA,利用Maxima First Strand cDNA Synthesisb Kits(Thermo Scientific公司)轉(zhuǎn)錄合成cDNA,引物購自Applied Biosyst
8、ems公司,利用Maxima SYBR Green qPCR Master MIXES(美國Thermo)的試劑定量PCR分析進行重復(fù)檢測mRNA的表達,GAPDH作為內(nèi)對照。TaqMan miRNA assays(Applied Biosystems公司)監(jiān)測miRNA表達,U6RNA作為內(nèi)參照。
流式細胞儀檢測
流量分析,PE共軛抗體人抗TLR4抗體0.5×106個細胞染色(12-9917-42,eBioscie
9、nce公司),或同型對照(12-4724-81,eBioscience公司),流式細胞儀分析。用CellROX Deep Red Reagent(Life Technologies公司)檢測ROS水平。FlowJo軟件分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
結(jié)果:
1.LPS促進肺癌進展
為研究LPS在肺癌腫瘤細胞生長過程中的作用,用不同劑量的LPS(0.1ug/ml、1ug/ml、10ug/ml)刺激肺癌細胞,觀察細胞的生長。結(jié)
10、果顯示肺癌細胞的生長與LPS存在劑量依賴性。在肺癌細胞中能快速發(fā)現(xiàn)TLR4。TLR4被LPS刺激后,表達明顯上調(diào),與劑量呈正相關(guān)。為研究TLR4、LPS在肺癌細胞生長中的作用,將肺癌原代細胞轉(zhuǎn)染上TLR4shRNA,然后給予LPS刺激調(diào)控。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染上TLR4shRNA的肺癌細胞,TLR4在mRNA和蛋白水平上的表達均降低,并阻礙脂多糖誘導(dǎo)肺癌原代細胞的生長。這些數(shù)據(jù)表明TLR4是LPS誘導(dǎo)的腫瘤細胞生長的關(guān)鍵受體。
為確定在活
11、體上LPS促肺癌細胞生長過程中的作用,將肺癌細胞注入小鼠體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)有LPS刺激的肺癌細胞生長速度明顯高于無LPS刺激的肺癌細胞。阻斷TLR4后,就減緩了肺癌細胞生長。
實質(zhì)上,這些結(jié)果表明通過LPS激發(fā)TLR4后可促進肺癌細胞生長。
2.LPS促進肺癌細胞生長中需要MiR-21
為評估MiR-21在LPS促進肺癌細胞生長中的作用,觀察MiR-21在肺癌細胞中的表達。發(fā)現(xiàn)MiR-21與LPS存在劑量依賴性。L
12、PS促進肺癌細胞生長過程中,阻斷TLR4后,MiR-21的表達同樣也出現(xiàn)抑制。當(dāng)肺癌細胞轉(zhuǎn)染miR-21shRNA后,LPS激活肺癌細胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21shRNA的肺癌細胞表達降低,并阻斷了LPS誘導(dǎo)的腫瘤生長。
為研究miR-21在LPS促進肺癌細胞體內(nèi)生長過程中的潛在作用,將轉(zhuǎn)染miR-21shRNA和預(yù)處理LPS的肺癌細胞種植于裸鼠體內(nèi),結(jié)果顯示下調(diào)miR-21表達會減弱LPS增強肺癌細胞增長。這些結(jié)果表明LPS促
13、進肺癌細胞增長是需要miR-21強化的。
3.MiR-21促進肺癌細胞生長
假定MiR-21在LPS誘導(dǎo)腫瘤生長中的重要作用,發(fā)現(xiàn)了miR-21自身促肺癌細胞生長的功能。轉(zhuǎn)染miR-21的肺癌細胞導(dǎo)致miR-21表達上調(diào)和腫瘤生長。轉(zhuǎn)染miR-21shRNA緩解肺癌細胞生長。為證實在體內(nèi)的研究結(jié)果,將轉(zhuǎn)染miR-21及miR-21shRNA的肺癌細胞分別植入裸鼠內(nèi),發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)增加miR-21表達增強腫瘤生長,降低mi
14、R-21表達會減弱腫瘤生長。這些發(fā)現(xiàn)認為miR-21是肺癌腫瘤生長的必須致癌miRNA。
眾所周知m iR-21作用于磷酸酶基因(PTEN)和程序性細胞死亡因子(PDCD4),但是否在肺癌細胞中miR-21亦作用于PTEN和(PDCD4)。轉(zhuǎn)染miR-21的表達降低了PTEN和PDCD4的表達。反之亦然,轉(zhuǎn)染miR-21shRNA使PTEN和PDCD4的表達上調(diào)。更重要的是,PTEN和PDCD4的過度表達會阻斷肺癌細胞生長中m
15、iR-21的致癌作用。這些數(shù)據(jù)表明在肺癌中PTEN和PDCD4是miR-21主要作用目標(biāo)。
4.LPS引起miR-21表達,引起細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增加
活性氧(ROS)參與TLR4激發(fā)的免疫應(yīng)答和肺癌進展。發(fā)現(xiàn)肺癌細胞內(nèi)ROS水平與LPS濃度呈正相關(guān),LPS濃度愈高,ROS水平亦愈高。結(jié)果表明在肺癌細胞中LPS促進ROS的產(chǎn)生。阻斷TLR4后則阻斷LPS誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生。為研究LPS誘導(dǎo)肺癌生長中ROS的作用,將LPS
16、處理的肺癌細胞,再用Tempol(4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶)消除ROS。結(jié)果顯示,Tempol阻斷了LPS誘導(dǎo)肺癌生長。發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)miR-21表達需要ROS,并發(fā)現(xiàn)Tempol阻斷miR-21與LPS正相關(guān)性。
為研究在體內(nèi)LPS誘導(dǎo)肺癌細胞生長中ROS的作用,將含或無Tempol的LPS預(yù)處理的肺癌細胞注入裸鼠內(nèi),結(jié)果顯示在體內(nèi)有Tempol的肺癌細胞抑制了LPS誘導(dǎo)的腫瘤生長。
總之,ROS產(chǎn)生增
17、加是LPS誘導(dǎo)miR-21表達和腫瘤生長是至關(guān)重要的。
5.在肺癌病人中TLR4表達與miR-21表達和ROS產(chǎn)生具有相關(guān)性
為證實在臨床上這些研究結(jié)果,分析了腫瘤組織和正常組織中TLR4和miR-21的表達。結(jié)果顯示TLR4和miR-21的表達在腫瘤組織中明顯增高。進一步分析,未接受治療的肺癌細胞TLR4、miR-21的表達和ROS水平。分析發(fā)現(xiàn)TLR4表達與miR-21表達和ROS水平存在相關(guān)性。在肺癌細胞中RO
18、S水平與miR-21表達具有正相關(guān)性。
這些結(jié)果表明在肺癌病人腫瘤進展中存在TLR4/ROS/miR-21通路。
結(jié)論:
在肺癌細胞中,LPS活化TLR4后導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加,又增加miR-21的表達和腫瘤增長。TLR4表達與miR-21表達和ROS水平存在緊密相關(guān)性,表明未治療的肺癌細胞存在TLR4/ROS/miR-21通路。這些結(jié)果揭示了個新的機制:革蘭氏陰性桿菌能加速肺癌進展,并為治療肺癌病人提供新的
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