高爾基體蛋白ACBD3參與腸道病毒復(fù)制的機(jī)制研究.pdf

1、腸道病毒71型(EV71)是引起嬰幼兒重癥手足口病的主要病原體，其感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)性疾病，包括無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎和神經(jīng)性肺水腫等。近年來(lái)大規(guī)模發(fā)生的手足口病疫情，嚴(yán)重危害嬰幼兒、尤其是農(nóng)村地區(qū)幼兒的身體健康，給公共衛(wèi)生的發(fā)展帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。
　　EV71屬于小RNA科病毒，報(bào)道表明小RNA病毒科病毒利用宿主細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)進(jìn)行自身基因組的復(fù)制。病毒感染導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)發(fā)生改變，富集病毒復(fù)制所需因子，形成不同于細(xì)胞內(nèi)膜的膜結(jié)構(gòu)，

2、包含不同的蛋白組分和脂質(zhì)組分，即病毒復(fù)制中心。病毒利用復(fù)制中心的宿主因子和病毒自身蛋白完成復(fù)制。最初報(bào)道表明高爾基體蛋白GBF1和ARF1在病毒復(fù)制中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，ACBD3介導(dǎo)嵴病毒3A蛋白募集病毒復(fù)制重要蛋白PI4KB至病毒復(fù)制中心。多種腸道病毒的3A蛋白也可以與ACBD3相互作用，但這種相互作用在不同病毒復(fù)制中的作用和機(jī)制不同，如柯薩奇病毒和鼻病毒的3A可以與ACBD3結(jié)合，但ACBD3并不參與二者的復(fù)制。目前，有關(guān)A

3、CBD3在腸道病毒復(fù)制中的作用仍存在爭(zhēng)議。前期通過(guò)酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)EV71的3A蛋白能與ACBD3相互作用。因此，本課題圍繞ACBD3在EV71病毒復(fù)制中的作用和分子機(jī)制進(jìn)行深入的研究，以期進(jìn)一步闡明EV71的復(fù)制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在的抗病毒藥物靶標(biāo)，為病毒致病機(jī)理和抗病毒藥物的設(shè)計(jì)研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　通過(guò)外源性共轉(zhuǎn)染3A和ACBD3蛋白，驗(yàn)證了ACBD3和3A的相互作用。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)病毒感染后，EV713A也可以與內(nèi)源性ACBD3共定

4、位，并影響ACBD3在細(xì)胞內(nèi)的分布。利用RNAi敲低ACBD3的表達(dá)，或是利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除ACBD3的表達(dá)后EV71病毒基因組的復(fù)制、蛋白的翻譯及空斑形成能力均受到了抑制。而當(dāng)回復(fù)ACBD3的表達(dá)后，病毒基因組的復(fù)制、蛋白的翻譯及空斑形成能力又可以得到拯救。通過(guò)突變和免疫共沉淀定位了ACBD3與3A相互作用的關(guān)鍵區(qū)域，發(fā)現(xiàn)ACBD3的C端在其與3A結(jié)合中起著關(guān)鍵作用，而3A的41-86AA在其與ACBD3結(jié)合中十分重要

5、。同時(shí)通過(guò)點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)EV713A的第44位異亮氨酸和第54位的組氨酸是二者相互作用中的關(guān)鍵位點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明，ACBD3通過(guò)與EV71的3A蛋白結(jié)合參與病毒復(fù)制。
　　此外，參與EV71復(fù)制的另外一個(gè)重要分子是PI4KB，但在EV71復(fù)制中如何募集至復(fù)制中心還不是十分清楚。首先驗(yàn)證了PI4KB是否參與EV71復(fù)制，發(fā)現(xiàn)PI4KB的抑制劑能抑制EV71病毒的復(fù)制，同時(shí)，利用RNAi技術(shù)敲低PI4KB的表達(dá)或是利用CRISPR/Cas

6、9技術(shù)敲除PI4KB的表達(dá)后EV71病毒基因組的復(fù)制、蛋白的翻譯及空斑形成能力均受到了抑制。進(jìn)一步研究PI4KB募集至復(fù)制中心的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)EV713A能夠增強(qiáng)PI4KB與ACBD3間的相互作用，并且感染后三者均定位于病毒的復(fù)制中心，同時(shí)，EV71病毒感染細(xì)胞后能導(dǎo)致復(fù)制中心附近PI4P的量的增加，而這些過(guò)程均需要ACBD3的參與。分子篩層析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在EV71病毒感染細(xì)胞后，會(huì)形成一個(gè)含有ACBD3，PI4KB，EV71-3A及EV71

7、-3D的大分子復(fù)合物。EV71-3A第44位及第54位氨基酸的突變同樣會(huì)抑制ACBD3與PI4KB的結(jié)合。最后，發(fā)現(xiàn)ACBD3同樣參與到EV68病毒的復(fù)制過(guò)程中，而對(duì)HRV16病毒的復(fù)制不起作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，PI4KB參與EV71病毒的復(fù)制，并通過(guò)形成3A-ACBD3-PI4KB分子復(fù)合物的形式促進(jìn)EV71及EV68病毒的復(fù)制，而HRV16的復(fù)制機(jī)制還需后續(xù)深入研究。該研究結(jié)果闡述ACBD3在腸道病毒復(fù)制過(guò)程中的作用機(jī)制。