IL3-LDM靶向融合蛋白對人急性髓系白血病NOD-SCID小鼠模型的治療作用研究CD26慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行討論：
　　第一部分 IL3-LDM靶向融合蛋白對人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的治療作用研究
　　目的:利用分離的人外周血單個核細(xì)胞建立急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型，觀察小鼠的一般情況、應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD45細(xì)胞陽性率，病理學(xué)檢查鑒定動物模型;利用該模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白對白血病小鼠的治療作用。
　　方法:1.人外周血單個核細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀

2、檢測其免疫表型，進(jìn)行AML干細(xì)胞特性的鑒定;
　　2.人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的建立:將NOD/SCID小鼠隨機分為模型組和對照組，兩組小鼠經(jīng)全身X線照射300cGay，6-12個小時內(nèi)通過尾靜脈注射AML病人樣本中CD123陽性率最高的人外周血單個核細(xì)胞(用臺盼藍(lán)拒染法，細(xì)胞活性95％，1×107個/只，液體總量0.2 ml)到模型組小鼠，對照組小鼠通過尾靜脈注射等體積PBS作為正常對照;
　　3.急性髓系

3、白血病NOD/SCID小鼠模型的鑒定:觀察小鼠的一般情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血CD45細(xì)胞陽性率;移植60天后處死小鼠，采用組織病理檢查，檢測小鼠肝臟、脾臟、肺臟等的白血病特征。
　　4.利用上述建立的模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白對白血病小鼠的治療作用，設(shè)置多個治療組，并進(jìn)行療效評價。
　　結(jié)果:1.分離并培養(yǎng)人外周血單個核細(xì)胞，經(jīng)抗人CD34-PE、CD38-FITC、CD123-PerCPcy5.5抗體標(biāo)記后，

4、流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示有CD34+CD38-細(xì)胞群，而且CD123+細(xì)胞占AML干細(xì)胞的比例均為90％以上。
　　2.成功建立人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型:移植后的模型組小鼠均發(fā)生典型白血病表現(xiàn)，而對照組小鼠無;模型組小鼠的尾血中檢測CD45+細(xì)胞，而對照組小鼠無;模型組NOD/SCID小鼠的肝、脾、肺等均有腫瘤細(xì)胞浸潤，細(xì)胞呈團(tuán)塊狀生長，包繞器官或者浸潤器官內(nèi)部，受浸潤組織結(jié)構(gòu)破壞，而對照組小鼠的相應(yīng)組織未發(fā)現(xiàn)明顯腫

5、瘤細(xì)胞浸潤。
　　3.體內(nèi)實驗證明，經(jīng)IL3-LDM靶向融合蛋白治療后，白血病模型小鼠組一般情況明顯好于模型組（PBS對照組），其外周血的白血病細(xì)胞含量明顯下降，其肺、腎、脾等臟器的炎癥及病理變化減輕。
　　結(jié)論:采用NOD/SCID小鼠在給予全身照射的移植前預(yù)處理基礎(chǔ)上成功建立了人急性髓系白血病的動物模型，為研究AML的可能發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。體內(nèi)實驗進(jìn)一步證實，IL3-LDM靶向融合蛋白對白血病細(xì)胞有一定的殺傷抑制作用，

6、IL3-LDM融合蛋白也為臨床治療AML提供了新思路。
　　第二部分 CD26慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
　　CD26作為一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白酶類，在炎性反應(yīng)、組織修復(fù)、細(xì)胞移行、腫瘤侵襲、免疫調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞、凋亡等生理及病理過程中均起到重要作用。在臨床中與多種腫瘤疾病存在相關(guān)性，可以作為腫瘤的預(yù)測因子或生物標(biāo)志物。針對CD26的深入研究，對于揭示相關(guān)腫瘤疾病的發(fā)病機制，促進(jìn)臨床診斷、鑒別分析，

7、分子靶向治療的開展和判定療效及預(yù)后等，均不失有潛在的重要意義，CD26也有望成為未來疾病治療的新靶點。
　　目的:構(gòu)建人CD26慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞株。
　　方法:抽提含pCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒載體的質(zhì)粒和pEZ-Lv105-CD26質(zhì)粒。利用XBaⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切，用T4連接酶將膠回收的CD26目的片段克隆至載體pCDH1-MCS1-EF1

8、-copGFP，構(gòu)建形成pCDH-CD26質(zhì)粒。轉(zhuǎn)化DH5à感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR初步篩選出陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定和送測序分析。利用三質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，生產(chǎn)慢病毒并檢測獲得的病毒滴度。利用所獲得的慢病毒感染NIH/3T3細(xì)胞，通過FACS AriaⅢ(BD公司)流式細(xì)胞儀分選出表達(dá)CD26的陽性細(xì)胞，并進(jìn)一步用FACS做分析鑒定，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞株。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建pCDH-CD26慢病毒表達(dá)載體