靶向白血病干細(xì)胞的抗CD3-IL3及其二硫鍵穩(wěn)定構(gòu)型的融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及活性研究.pdf

1、背景與目的：白血病的發(fā)生、治療中耐藥乃至白血病復(fù)發(fā)的根本原因在于患者體內(nèi)存在著一群白血病干細(xì)胞(LSC)。它跟正常的干細(xì)胞一樣具有自我更新和分化潛能。它在全血細(xì)胞中僅占0.25—1.0％。傳統(tǒng)的白血病治療通常是細(xì)胞毒藥物的聯(lián)合化療配合造血干細(xì)胞移植,然而這種方法選擇性差,在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也損害體內(nèi)某些類型的正常細(xì)胞,而且只能殺死大部分已分化的腫瘤細(xì)胞不能殺死腫瘤干細(xì)胞,因此造成腫瘤治療效果的不理想。所以,只有靶向腫瘤干細(xì)胞的治療才能

2、使惡性腫瘤治愈。在白血病干細(xì)胞表面具有一些不同于正常干細(xì)胞的表面標(biāo)志。針對這些表面標(biāo)志的靶向治療將有效地靶向腫瘤干細(xì)胞而對正常干細(xì)胞沒有任何損傷。研究發(fā)現(xiàn)CD123是AML干細(xì)胞所特有的表面標(biāo)志,其在正常造血干細(xì)胞(CD34+,CD38-)的表達(dá)<1％,而在急性髓系白血病干細(xì)胞的的表達(dá)>99％。除此之外,CD123在其他白血病細(xì)胞的表面也有表達(dá)。
　　 人白細(xì)胞介素3(IL-3)是CD123的配體,是造血干細(xì)胞增殖分化的正性調(diào)節(jié)

3、因子,可刺激多能干細(xì)胞和多種祖細(xì)胞的增殖與分化。IL-3還可增強(qiáng)白血病細(xì)胞對某些化療藥物敏感性,能選擇性地誘導(dǎo)白血病細(xì)胞進(jìn)人細(xì)胞周期,使周期特異性化療藥物對急性粒細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞的毒性增強(qiáng)。此外IL-3還可與IL4協(xié)同作用,促進(jìn)T淋巴細(xì)胞前體細(xì)胞的發(fā)育,誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞自分泌生長,IL3可直接或間接地影響細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞的成熟和增殖。
　　 基于外周血淋巴細(xì)胞(Peripheral blood lymphocyte

4、,PBL)的生物治療已經(jīng)成為重要的抗腫瘤策略之一。PBL中的T細(xì)胞可以通過與腫瘤細(xì)胞接觸形成T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞突觸樣結(jié)構(gòu),直接對腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞殺傷作用。然而,T細(xì)胞識別過程的復(fù)雜給腫瘤細(xì)胞提供了很多機(jī)會來逃逸T細(xì)胞對其特異性識別,因此腫瘤細(xì)胞得以存活并增殖。CD3是T淋巴細(xì)胞表面特異分子,通過它可以募集具有殺傷作用的T淋巴細(xì)胞。
　　 本實(shí)驗(yàn)基于此構(gòu)建了抗CD3抗體的Fv與IL3融合形成的抗CD3-IL3融合蛋白,并且通過改造獲

5、得了表達(dá)量高、穩(wěn)定性好的抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白。為增強(qiáng)抗CD3-m2IL3,抗CD3-⊿IL3融合蛋白的穩(wěn)定性,在VL間VH引入了人二硫鍵,表達(dá)并純化后測定它們體外生物學(xué)活性和介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的作用。
　　 方法：用重疊PCR(Overlap PCR)和PCR方法,構(gòu)建抗CD3/IL3表達(dá)載體pAYZCD3/IL3,再用PCR法通過引物在抗CD3VL-100位和抗CD3VH-44位引入半胱氨酸突變

6、,構(gòu)建二硫鍵穩(wěn)定的抗CD3/IL3表達(dá)載體pAYZCD3*/IL3,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌16C9進(jìn)行原核表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)6×His-tag親和層析柱分離純化,12％SDS—PAGE電泳及westen-blot鑒定。用同樣的方法表達(dá)抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白。應(yīng)用間接免疫熒光和競爭性免疫熒光結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)(FACS)檢測抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗

7、CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3融合蛋白與CD123+M07e細(xì)胞和CD3+Jurkat細(xì)胞的結(jié)合活性,將4種融合蛋白在0.2％的人血清白蛋白中37℃溫育不同時(shí)間點(diǎn)至72h后,通過間接免疫熒光法FACS檢測其結(jié)合活性,并比較二者的穩(wěn)定性。
　　 利用非放射性熒光染料Calcein-AM進(jìn)行抗體介導(dǎo)的體外特異性殺傷活性檢測,Ficoll-Hypaque法分離外周血淋巴細(xì)胞(PBL)作為效應(yīng)細(xì)胞,首先以TF1細(xì)胞或M07e或A

8、ML病人干細(xì)胞(CD34+CD38-CD123+為靶細(xì)胞,按不同效靶比,不同抗體濃度設(shè)組,以PBS,抗CD3/抗CD19雙功能抗體為對照,另設(shè)CD123-的k562細(xì)胞為非相關(guān)靶細(xì)胞組,比較融合蛋白介導(dǎo)的特異性體外殺傷活性。取上述殺傷實(shí)驗(yàn)效靶比25:1,融合蛋白濃度500ng/ml各組,實(shí)時(shí)定量PCR檢測各組穿孔素(Perforin)和顆粒酶A(Granzyme A)的釋放。
　　 結(jié)果：基因重組質(zhì)粒pAYZCD3*/IL3、p

9、AYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZ CD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3經(jīng)測序證實(shí)序列正確,構(gòu)建成功。抗CD3*/IL3在原核表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行可溶性表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)6×His-tag蛋白純化柱純化,濃縮后,12％SDS-PAGE顯示在27kD,30KD和57kD各有一條帶,但western-blot顯示在30KD和57kD均有帶,與預(yù)測結(jié)果一致。但后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pAY

10、ZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3的穩(wěn)定性差,極易發(fā)生沉淀和降解。流式檢測發(fā)現(xiàn)該蛋白與CD3單抗HIT3A有競爭活性,但與抗CD123單抗競爭活性很弱；ELISA檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),純化蛋白中活性IL3的含量很低,約為蛋白定量結(jié)果的104分之一,所以我們推測IL3的一端發(fā)生了斷裂或蛋白構(gòu)象發(fā)生了變化。改造后的抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3非還原性SDS-PAGE中,在57KD、30kD和27KD有條,western-bl

11、ot在57KD和30KD顯示有帶；還原性SDS-PAGE顯示57KD帶消失,在30kD和27kD各有一條帶,western-blot在30kD顯示有帶,這些均與理論相符。57KD為二硫鍵穩(wěn)定的二聚體,在還原劑巰基乙醇作用下二硫鍵斷開,形成30kD和27kD的2條帶。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化定量抗CD3*-m2IL3可達(dá)1mg/L,抗CD3*-⊿IL3可達(dá)2mg/L。FACS檢測四種融合蛋白均可與CD123+M07e細(xì)胞和CD3+Jurkat細(xì)胞特

12、異結(jié)合,并能競爭性抑制單抗AntiCD123和HIT3a與上述細(xì)胞的結(jié)合。體外血清穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗CD3*-m2IL3、抗CD3*-⊿IL337℃72h后活性基本不變,而抗CD3-m2IL3、抗CD3-⊿IL3則遞減至消失,證明引入二硫鍵可增加蛋白的穩(wěn)定性。
　　 抗CD3*-m2IL3、抗CD3-m2IL3、抗CD3*-⊿IL3、抗CD3-⊿IL3體外介導(dǎo)T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞TF1、M07e細(xì)胞的效果比對照組明顯(p<0.05),

13、激活T細(xì)胞釋放Perforin和Granzyme A的量均明顯高于對照組(p<0.05)。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pAYZCD3*/IL3、pAYZCD3/IL3、pAYZ CD3*/m2IL3、pAYZCD3/m2IL3,pAYZCD3*/⊿IL3及pAYZCD3/⊿IL3的表達(dá)載體并獲得了可溶性表達(dá),改造后的抗CD3*/m2IL3、抗CD3/m2IL3,抗CD3*/⊿IL3及抗CD3/⊿IL3,其穩(wěn)定性或活性均有明顯提