肌層浸潤性膀胱癌中長鏈非編碼RNA和miRNA差異表達譜及相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見腫瘤之一，嚴重危害人類的健康。肌層浸潤性膀胱癌復(fù)發(fā)率及死亡率均較非肌層浸潤性膀胱癌顯著增高，是膀胱癌研究中的重點與熱點。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是指一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，其自身不編碼蛋白。最初lncRNA被認為在基因組轉(zhuǎn)錄中不起作用，近年來，這些過去被認為是“垃圾序列”的lncRNA越來越引起學者的重視，其具有重要的生物學功能。研究表明，對于某些特定的ln

2、cRNA，其在正常組織和腫瘤組織中表達水平有明顯差異，而且有些差異和腫瘤的分期及預(yù)后也密切相關(guān)。目前，lncRNA相關(guān)研究已成為腫瘤分子生物學研究熱點，就泌尿系腫瘤來講，前列腺癌相關(guān)lncRNA研究開始較早，相關(guān)熱點lncRNA包括前列腺癌基因表達標志物1(PCGEM1)、前列腺特異性抗原3(DD3/PCA3)、前列腺癌非編碼RNA1(PRNCR1)等。膀胱癌方面的相關(guān)lncRNA研究尚處于研究進展期。
　　lncRNA和miRN

3、A的相互作用在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要調(diào)節(jié)作用。2011年，競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)假說在此基礎(chǔ)上被提出，并被越來越多的研究試驗所證實。ceRNA并非是一種新發(fā)現(xiàn)的RNA，而是一種RNA相互作用的調(diào)節(jié)機制，這一機制認為lncRNA、miRNA、mRNA及其它RNAs之間是功能互相調(diào)控的，這些RNA之間正常時處于一種平衡穩(wěn)態(tài)，一旦其中某一個或幾個RNA表達出現(xiàn)異常上調(diào)或下調(diào)，它們之

4、間的這種平衡穩(wěn)態(tài)就會失衡破壞，就會導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生。lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)作為一種新的假說，越來越被研究重視，并已在胃癌、乳腺癌、胰腺癌和肝癌中得以構(gòu)建。目前仍缺乏在全基因組范圍內(nèi)，特別是基于高通量檢測與大規(guī)模樣本量的肌層浸潤性膀胱癌相關(guān)的lncRNA和miRNA及的ceRNA的綜合分析。
　　癌癥基因圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)項目組最初由美國國家腫瘤研究所(

5、NCI)和美國國家人類基因組研究所(NHGRI)組成，目前其中已經(jīng)收集了超過30種人類癌癥種類，共約10000例患者樣本和臨床病理信息，并且數(shù)據(jù)全部免費開放，TCGA的最終目標為所有的癌癥基因組構(gòu)建一套相關(guān)的完整“圖譜”。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，免費數(shù)據(jù)不僅包括全而詳實的臨床病例資料，還包括患者分子水平測序結(jié)果。目前，已經(jīng)有超過5萬個lncRNA基因在人類基因組中被克隆和鑒定，但僅有其中極少一部分的生物學功能得到相關(guān)驗證。如何尋找特定腫瘤的

6、功能性lncRNA是相當困難的。TCGA數(shù)據(jù)庫相當于腫瘤臨床及分子信息的一個蘊藏豐富的寶庫，如何從這一寶庫中甄選出我們希望挖掘的寶藏，就需要嚴謹科學的工具。這就需要借助生物信息學工具，及相關(guān)測序統(tǒng)計工具，我們可以從大數(shù)據(jù)中摒棄無關(guān)信息，發(fā)現(xiàn)潛在研究位點。
　　研究方法：
　　生物信息學是計算機科學、數(shù)學和生物學界面的一門多學科的交叉學科。它依賴計算機科學、工程和應(yīng)用數(shù)學的基礎(chǔ)，依賴實驗和衍生數(shù)據(jù)的大量貯存。在本研究中，借助生

7、物信息學分析技術(shù)，通過TCGA數(shù)據(jù)庫提取共341個樣本的3級RNAseq和miRNASeq數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分為2個隊列:322例肌層浸潤性膀胱癌和19例正常樣本。腫瘤樣本與正常樣本數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)處理后，所有未表達的RNA數(shù)據(jù)和miRNA數(shù)據(jù)被濾除。所得數(shù)據(jù)通過DESeq軟件進行處理，得到肌層浸潤性膀胱癌差異表達RNA(differentially expressed RNA，DERNA)和差異表達miRNA(differentially exp

8、ressed miRNA，DEmiRNA)，進而借助GENCODE lncRNA數(shù)據(jù)庫（第22版）從中確認差異表達lncRNA。得到肌層浸潤性膀胱癌的DElncRNA和DEmiRNA后，借助miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測lncRNA-miRNA的相互作用，借助miRTarBase數(shù)據(jù)庫檢索miRNA靶向的mRNAs，進而成功構(gòu)建其lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。
　　為進一步論證TCGA數(shù)據(jù)庫分析得出的肌層浸潤性膀

9、胱癌中長鏈非編碼RNA差異表達譜的科學性，我們篩選研究中預(yù)測的3個表達上調(diào)lncRNA(LINC00162、AATBC、UCA1)和4個表達下調(diào)lncRNA(MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1)做進一步的初步試驗驗證。通過Real-Time PCR檢測32對肌層浸潤性膀胱癌和癌旁正常組織標本中上述7個差異表達lncRNA，并進一步選取目前尚未在膀胱癌中報道的長鏈非編嗎RNA HAND2-A

10、S1做進一步初步功能驗證。通過Real-Time PCR檢測HAND2-AS1在SV-HUC-1和膀胱癌細胞株5637，RT4和J82的表達情況，進一步通過MTT計數(shù)法和劃痕實驗、Transwell，我們驗證了HAND2-AS1對膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1.肌層浸潤性膀胱癌中l(wèi)ncRNA和miRNA差異表達譜及相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析研究
　　1.1.肌層浸潤性膀胱癌中的差異表達R

11、NA(differentially expressed RNAs，DERNAs)
　　研究將322個肌層浸潤性膀胱癌腫瘤組織（隊列T）和19個正常組織(隊列N)中的RNA的表達水平進行研究。差異表達基因定義為差異倍數(shù)(log2)絕對值大于1且校正P值小于0.01的基因。通過此標準進行計算機處理，結(jié)果共有472(34.08％)個表達上調(diào)和913(65.92％)個表達下調(diào)的RNA被確認（見附表1）。同時，為了更好地解釋肌層浸潤性膀胱癌

12、發(fā)生的相關(guān)機制，這些差異表達DERNA的功能特性被通過KOBAS2.0進行KEGG分析。27個DERNA（包括21個表達上調(diào)者和6個表達下調(diào)者）被發(fā)現(xiàn)參與細胞周期。
　　1.2.肌層浸潤性膀胱癌中的差異表達lncRNA(differentially expressed lncRNAs，DElnRNAs)
　　根據(jù)差異倍數(shù)(log2)絕對值＞1.5和校正P值＜0.01這一判定標準，在肌層浸潤性膀胱癌中，我們發(fā)現(xiàn)有4個lncRN

13、A（LINC00162、AATBC、UCA1和EPR1）的表達顯著上調(diào)，有7個lncRNA(MIR2HG、MIR100HG、BRE-AS1、M1R143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1和PGM5-AS1，)被證明表達下調(diào)。根據(jù)腫瘤組織樣本病理TNM分期，將樣本分為T3+T4對比T1+T2， N2+N3對比N0+N1，M1對比M0以及有淋巴脈管浸潤對比無淋巴脈管浸潤這些亞組，進而對樣本的lncRNA表達譜進行相關(guān)的比較

14、分析，我們確定了8個表達上調(diào)lncRNA(LINC00221、UCA1、ZFHX4-AS1、LINC00284、LOC283731、LINC00698、CNTFR-AS1和LOC284379)和4個表達下調(diào)lncRNA（LINC00390、SSTR5-AS1、HECTD2-AS1和LOC400696）和肌層浸潤性膀胱癌的疾病進展分期密切相關(guān)。
　　1.3.肌層浸潤性膀胱癌中的差異表達miRNA(differentially exp

15、ressed miRNAs，DEmiRNAs)
　　為了構(gòu)建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)，我們還比較了腫瘤組織和正常組織中的miRNA表達譜。確定了11個差異表達miRNA，包括2個表達上調(diào)和9個表達下調(diào)的miRNA。利用Kaplan-Meier曲線分析法研究肌層浸潤性膀胱癌患者DEmiRNA相關(guān)的總生存率，這11個DEmiRNA中有5個（包括let-7c、mir-100、mir-143、mir-1-2和m

16、ir-145）被證明與患者生存率相關(guān)。
　　1.4.肌層浸潤性膀胱癌中的相關(guān)eeRNA調(diào)控網(wǎng)的構(gòu)建
　　我們基于以上數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。分析得出有32個DERNA參與了ceRNA調(diào)控網(wǎng)，這32個DERNA中，部分已被報道為癌癥相關(guān)基因，如CDC25A、 CDKN1A、 MMP1、 MMP13和SOX4。同時，我們對調(diào)控網(wǎng)中所包含的DElncRNA和DERNA的表達水平進行了回歸

17、分析，結(jié)果顯示了參與ceRNA的lncRNA和mRNA表達水平之間具有非常一致甚至近乎完美的相互作用關(guān)系。我們還分析了參與ceRNA調(diào)控網(wǎng)的32個DERNA，分析了由DElncRNA間接調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路，證實有10條KEGG通路中上述DERNA顯著富集，其中包括4條腫瘤相關(guān)通路:腫瘤MicroRNAs、膀胱癌、細胞周期和慢性粒細胞白血病”。
　　2.肌層浸潤性膀胱癌中l(wèi)ncRNA差異表達譜的初步驗證及HAND2-AS1初步功能研

18、究
　　2.1.膀胱癌中相關(guān)差異表達lncRNA的real-time PCR檢測結(jié)果
　　我們從相關(guān)lncRNA差異表達譜中選取了3個預(yù)測表達上調(diào)和4個預(yù)測表達下調(diào)的lncRNA進行初步驗證。定量Real-Time PCR檢測了共計32對膀胱癌腫瘤組織和癌旁組織標本中7個lncRNA的表達情況。試驗結(jié)果表明:前期研究預(yù)測上調(diào)的lncRNA包括AATBC與UCA1，試驗結(jié)果與前期預(yù)測結(jié)果相符。前期研究預(yù)測下調(diào)的lncRNA包括

19、MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1，試驗結(jié)果與前期預(yù)測結(jié)果均相符。LINC00162在前期TCGA預(yù)測分析中為上調(diào)，Real-Time PCR試驗結(jié)果為下調(diào)。7個lncRNAs總體預(yù)測與試驗符合率為85.7％。
　　2.2.膀胱癌細胞株中HAND2-AS1基因的Real-Time PCR檢測結(jié)果
　　采用定量Real-Time PCR方法檢測SV-HUC-1，5637，RT4和

20、J82四株細胞系中HAND2-AS1的表達情況。結(jié)果顯示HAND2-AS1確實在膀胱癌細胞株中低表達。
　　2.3.HAND2-AS1對于膀胱癌細胞的增殖、侵襲及遷移的作用。
　　設(shè)計干擾RNA下調(diào)HAND2-AS1在5637細胞株中的表達，結(jié)果顯示干擾后細胞中HAND2-AS1的表達顯著降低，細胞增殖曲線顯示HAND2-AS1基因下調(diào)后，5637細胞的增殖明顯加快。同時，通過劃痕實驗及Transwell法對比分析，試驗初步

21、驗證HAND2-AS1抑制膀胱癌細胞的增殖、侵襲及遷移。
　　結(jié)論：
　　1.基于TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本肌層浸潤性膀胱癌標本數(shù)據(jù)分析，得出肌層浸潤性膀胱癌的差異表達lncRNA譜及差異表達miRNA譜，借此構(gòu)建相關(guān)lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA調(diào)控網(wǎng)。通過相關(guān)通路分析證實，肌層浸潤性膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中多種lncRNA與miRNA參與相關(guān)ceRNA調(diào)控網(wǎng)，在多項信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中共同發(fā)揮作用。
　　2.基于TC

22、GA數(shù)據(jù)庫大樣本肌層浸潤性膀胱癌標本數(shù)據(jù)分析，得出肌層浸潤性膀胱癌差異表達lncRNA表達譜，通過定量Real-Time PCR法初步驗證AATBC與UCA1在膀胱癌中表達顯著上調(diào)，MIR100HG、MIR143HG、C20orf166-AS1、HAND2-AS1在膀胱癌中表達顯著下調(diào)，其初步試驗結(jié)果與前期數(shù)據(jù)分析結(jié)果均一致。除此7個lncRNA外，尚有多個預(yù)測lncRNA需下一步試驗驗證。
　　3.基于TCGA數(shù)據(jù)庫大樣本肌層浸