高血壓小血管重構(gòu)的特征性改變及葡萄籽原花青素保護(hù)作用的機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓(Essential hypertension，EH)足以動(dòng)脈血壓持續(xù)升高為特點(diǎn)的“心血管綜合征”，也是最常見的慢性病之一，具有病程長(zhǎng)、病因復(fù)雜、健康損害和社會(huì)危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，是我國(guó)心腦血管病最主要的危險(xiǎn)因素和原因，是全世界公認(rèn)的重大公共衛(wèi)生問題。高血壓病主要的危害是針對(duì)重要臟器如心、腦、腎、血管的結(jié)構(gòu)與功能，最終導(dǎo)致這些器靶官的功能衰竭，危及患者生命安全和生活質(zhì)量，加重家庭和社會(huì)的負(fù)擔(dān)，一直是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。血管

2、重構(gòu)既是高血壓病發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)，又是靶器官受損的表現(xiàn)，對(duì)其進(jìn)行干預(yù)是目前高血壓病一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防的主要策略。
　　血管重構(gòu)(Vascular remodeling，VR)，其作為一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，不僅涵蓋細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡，還包括細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix, ECM)成分的合成、降解及重排;同時(shí)又是血管對(duì)各種刺激因子的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過程，包括信號(hào)的感知、傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)因子的合成、釋放，最終血管結(jié)構(gòu)改變出現(xiàn)。

3、最典型的特征包括中膜增厚、內(nèi)徑縮小和基質(zhì)增多，但不同的血管重構(gòu)有不同變化，現(xiàn)認(rèn)為大動(dòng)脈血管如主動(dòng)脈，以血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)肥大為主;小動(dòng)脈如腸系膜第三級(jí)動(dòng)脈，以增生為主?，F(xiàn)階段缺乏針對(duì)高血壓小動(dòng)脈重構(gòu)機(jī)制及干預(yù)的系統(tǒng)性研究。
　　大量血管重構(gòu)研究側(cè)重于血管內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小動(dòng)脈血管外膜的細(xì)胞成分:成纖維細(xì)胞(Adventitia fibroblast

4、，AF)在炎癥和細(xì)胞因子等病理刺激下通過激活、腔內(nèi)遷移和表型轉(zhuǎn)化參與并促進(jìn)血管重構(gòu)，使膠原蛋白過度合成、沉積于血管壁，具有不同于大動(dòng)脈血管重構(gòu)鮮明的特點(diǎn);而血管壁細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡失調(diào)也是小動(dòng)脈血管重構(gòu)過程中的重要細(xì)胞事件。
　　葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidins extracts，GSPE)是當(dāng)今世界公認(rèn)的清除自由基最有效的天然抗氧化劑。據(jù)報(bào)道GSPE能有效治療多種心血管疾病，包括動(dòng)脈

5、粥樣硬化、心肌再灌注損傷、高血壓及其靶器官損害等，但對(duì)血管重構(gòu)的作用，特別是對(duì)高血壓小動(dòng)脈重構(gòu)影響及機(jī)制研究鮮有報(bào)道。
　　本研究首先觀察比較43周齡自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneous hypertensiverat，SHR)主動(dòng)脈大血管與腸系膜小動(dòng)脈血管重構(gòu)的不同特點(diǎn)，以小動(dòng)脈重構(gòu)異于大動(dòng)脈的特征性改變一膠原增生為切入點(diǎn)，觀察成纖維細(xì)胞增生、遷移及表型轉(zhuǎn)化以及動(dòng)脈重構(gòu)時(shí)血管壁細(xì)胞凋亡和增殖的情況，從組織、細(xì)胞、分子多方面探

6、討小血管重構(gòu)可能的機(jī)制并給予不同劑量GSPE長(zhǎng)程干預(yù)，探討GSPE對(duì)高血壓小血管重構(gòu)的保護(hù)機(jī)制，以期為研究高血壓小血管重構(gòu)提供新思路和新的藥物作用靶點(diǎn)。
　　第一部分自發(fā)性高血壓大鼠大小血管重構(gòu)的差異性比較
　　研究背景：
　　流行病學(xué)資料證實(shí)，因經(jīng)濟(jì)迅速崛起導(dǎo)致的生活方式顛覆性地改變，使“生活方式病”發(fā)病率居高不下，其中高血壓病就是最常見的代表性疾病之一。高血壓病相關(guān)的心腦血管疾病，在我國(guó)已成為超過腫瘤的兇手，高血壓

7、病的靶器官損害以及不良預(yù)后對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和人民健康造成難以估測(cè)的負(fù)擔(dān)和損失，是心血管領(lǐng)域所面臨的重大挑戰(zhàn)。
　　血管重構(gòu)是多種危險(xiǎn)因素及疾病的病理基礎(chǔ)和靶器官損害。新近研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)脈結(jié)構(gòu)的異常改變是心血管事件的一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子。以增生肥厚為主要特點(diǎn)的高血壓小血管重構(gòu)，形態(tài)學(xué)特征為管壁明顯增厚，管腔明顯狹窄，與實(shí)驗(yàn)證據(jù)豐富的大動(dòng)脈重構(gòu)具有截然不同的特征性表現(xiàn)?，F(xiàn)階段針對(duì)高血壓小動(dòng)脈重構(gòu)機(jī)制及干預(yù)的系統(tǒng)性研究較少。
　　血管重構(gòu)在

8、發(fā)生血管管徑的改變的同時(shí)會(huì)伴隨血管壁成分的改變:血管壁細(xì)胞的增殖及活性改變、凋亡平衡失調(diào)及ECM合成、降解失衡以及分布異常等等。參與血管重構(gòu)的AF所合成分泌的膠原蛋白，是構(gòu)成ECM主要成分的一種非水溶性纖維蛋白，在維持組織器官結(jié)構(gòu)中起決定性作用。血管壁膠原構(gòu)成為Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原，當(dāng)膠原的合成多于降解、特性構(gòu)型及排列分布的變化是高血壓血管膠原重構(gòu)的根本原因。
　　本實(shí)驗(yàn)以Wista Kyoto大鼠(Wista Kyoto rat，

9、wKY)為正常血壓對(duì)照組動(dòng)物，以SHR為實(shí)驗(yàn)組，觀察對(duì)比43周齡SHR主動(dòng)脈及腸系膜小動(dòng)脈血管重構(gòu)的各自特征性變化，發(fā)現(xiàn)大動(dòng)脈血管重構(gòu)以血管壁細(xì)胞增生，尤其以血管平滑肌細(xì)胞肥大、增生為主:而小動(dòng)脈以ECM增生為主，尤以外膜膠原增生明顯，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血管壁細(xì)胞凋亡增多可能涉及到血管壁細(xì)胞增生和凋亡的平衡情況，共同為高血壓血管重構(gòu)的防治提供了新的理論基礎(chǔ)。
　　研究目的：
　　1.比較43周齡WKY和SHR大鼠血壓、體重及血脂、血糖

10、、腎功能的情況。
　　2.從形態(tài)學(xué)、組織、細(xì)胞多方面比較SHR主動(dòng)脈與腸系膜小動(dòng)脈血管重構(gòu)的不同特點(diǎn)。
　　3.從膠原增生的視角來論證高血壓小血管重構(gòu)的特征性改變。
　　4.評(píng)價(jià)血管壁細(xì)胞凋亡與增生平衡情況在不同血管重構(gòu)中的地位。
　　研究方法：
　　20周齡雄性SHR大鼠30只，隨機(jī)分為3組:模型對(duì)照組（SHR-C組）10只，GSPE小劑量干預(yù)組（SHR-L組）10只，GSPE大劑量干預(yù)組（SHR-H組）

11、10只。同周齡雄性WKY大鼠（WKY-C組）10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。每天清晨WKY-C組和SHR-C組給予1ml0.9％生理鹽水灌胃，而GSPE干預(yù)組分別給予100ug/kg，250ug/kgGSPE1ml灌胃。22周后用10％水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉動(dòng)物，取血后迅速分離4組大鼠腸系膜小動(dòng)脈及胸主動(dòng)脈組織。
　　實(shí)驗(yàn)第一部分比較WKY-C組和SHR-C組胸主動(dòng)脈和腸系膜小動(dòng)脈血管重構(gòu)的差異，第二部分將探討

12、GSPE對(duì)小血管重構(gòu)的保護(hù)作用及內(nèi)在機(jī)制。
　　1.實(shí)驗(yàn)期間每周尾套法測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓并稱重;
　　2.從腹主動(dòng)脈抽血，離心后取血清進(jìn)行總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯及血糖、肌酐、尿素氮的測(cè)定;
　　3.留取WKY-C、SHR-C兩組大鼠的腸系膜小動(dòng)脈、主動(dòng)脈組織，制作石蠟切片進(jìn)行蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色觀察比較大小動(dòng)脈形態(tài)的變化、天狼猩紅-維多利亞藍(lán)染色檢測(cè)膠原纖維增生和分布

13、變化、以間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡分析Ⅰ、Ⅲ膠原的分布和表達(dá)、透射電子顯微鏡觀察兩種動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化、TUNEL法及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)分別檢測(cè)血管壁細(xì)胞凋亡與增生情況、TUNEL-PCNA雙重染色顯示血管壁細(xì)胞凋亡與增生平衡情況。并留取組織凍存于-80℃冰箱用于第二部分相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
　　研究結(jié)果：
　　1.血壓和體重情況
　　隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，SHR-C組收縮壓顯著升高，

14、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);而兩組大鼠的體重變化無明顯差異。
　　2.血清血脂及血糖、血肌酐、尿素氮的情況
　　實(shí)驗(yàn)測(cè)得兩組大鼠的血清總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三脂及血糖、血肌酐、尿素氮均無顯著性差異(P＜0.05)。
　　3.兩組大鼠大小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化
　　3.1.HE染色
　　WKY-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈及主動(dòng)脈形態(tài)正常，各層分界清楚，排列規(guī)整。SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈管壁增厚，管腔狹窄，中

15、層VSMCs排列紊亂，外膜增厚明顯且細(xì)胞增生;主動(dòng)脈管壁增厚以中層增厚最為明顯，VSMCs增生肥大，中層彈性膜排列紊亂、厚薄不均且斷裂，部分內(nèi)膜脫落。
　　3.2.天狼猩紅-維多利亞藍(lán)雙染
　　天狼猩紅-維多利亞藍(lán)雙染明視野下觀察，WKY-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈與主動(dòng)脈均形態(tài)正常，藍(lán)綠色彈力板結(jié)構(gòu)清晰，紅色膠原纖維分布正常。SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈及主動(dòng)脈管壁顯著增厚，紅色膠原纖維重度增生，其中腸系膜小動(dòng)脈外膜膠原的增生更明顯

16、，其藍(lán)綠色單層內(nèi)彈力板無明顯變化;而主動(dòng)脈膠原增生以中層較明顯，多層彈性纖維板破壞，結(jié)構(gòu)紊亂。形態(tài)學(xué)檢測(cè)分析顯示，與WKY-C組相比，SHR-C組小動(dòng)脈內(nèi)徑(Inner diameter, ID)、血管腔橫截面積(luminal cross-sectional area，LCSA)明顯減小（P＜0.05），血管壁厚度(wall thickness，WT)、血管壁橫截面積(wall cross-sectionalarea，WCSA)、WT

17、/ID、WCSA/LCSA明顯增高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但主動(dòng)脈ID、LCSA、WT/ID明顯增大(P＜0.05)，WT、WCSA、WCSA/LCSA亦明顯增高(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.兩組大鼠大小動(dòng)脈膠原纖維的比較
　　Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)定量檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈、主動(dòng)脈膠原面積百分比均顯著高于WKY-C大鼠(P＜0.01)，以小動(dòng)脈增多更為明顯。<

18、br>　　5.兩組大鼠大小動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原分布
　　天狼猩紅-維多利亞藍(lán)雙染偏振光顯微鏡暗視野下可見:WKY-C組大鼠黃紅色Ⅰ型膠原纖維主要分布于外膜;綠色Ⅲ型膠原主要分布在中膜及外膜。SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈及主動(dòng)脈管壁膠原纖維明顯增生，排列紊亂，Ⅰ型膠原纖維增生延及中膜，Ⅲ型膠原纖維則彌漫分布于外膜及以外，大小動(dòng)脈相比，小動(dòng)脈膠原增加更為顯著，尤以外膜Ⅲ型膠原纖維明顯:大動(dòng)脈膠原增生主要分布在中膜，以Ⅰ型膠原為主。
　　

19、6.間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)WKY-C組大鼠動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常，可見正常密度的綠色膠原纖維及紅色細(xì)胞核。與其相比，SHR-C組動(dòng)脈管壁明顯增厚，細(xì)胞核數(shù)目明顯增多，Ⅰ、Ⅲ型膠原增多，彌漫分布于中膜及外膜。大小動(dòng)脈相比，小動(dòng)脈膠原增加最為明顯，尤以外膜顯著，大動(dòng)脈血管壁細(xì)胞核增多明顯，以中膜更為明顯。熒光定量分析結(jié)果(IOD)顯示:與WKY-C組比較，SHR-C組大血管壁(P＜0.05)及小血管壁(P

20、＜0.01)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)均增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小血管Ⅲ型膠原增生更為明顯。
　　7.兩組大鼠大小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)變化
　　透射電鏡下WKY-C組大鼠動(dòng)脈組織膠原多分布于血管外膜，少量分布于中膜，內(nèi)皮細(xì)胞、VSMCs以及外膜的AF形態(tài)正常。SHR-C組血管內(nèi)膜損傷明顯，可見凋亡細(xì)胞;腸系膜小動(dòng)脈中膜VSMCs增生、排列紊亂，外膜膠原纖維增生明顯，伴有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張的成纖維細(xì)胞遷移至中膜，甚至遷移的AF出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化特征:細(xì)胞膜下

21、密斑形成;主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷尤為嚴(yán)重，部分脫落，基底膜呈蟲蝕樣增生修復(fù)，彈力層斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，VSMCs肥大增生，胞漿內(nèi)細(xì)胞器增多，膠原增生主要存在于中膜，外膜AF變化不明顯。
　　8.TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞
　　TUNEL法檢測(cè)各組大鼠血管壁凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核被染成棕黃色。與WKY-C組相比，SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈組織凋亡細(xì)胞明顯增多，凋亡指數(shù)(apop幻ticindex，AI)明顯增大(P＜0.01)，而

22、主動(dòng)脈壁細(xì)胞凋亡AI亦有增多(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　9.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)
　　PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示:增殖狀態(tài)的血管壁細(xì)胞核被染成棕黃色。與WKY-C組相比，SHR-C組大鼠大小動(dòng)脈組織增殖細(xì)胞明顯增多，其中腸系膜小動(dòng)脈組織增殖指數(shù)(proliferation index，PI)增加(P＜0.05)，主動(dòng)脈組織PI增加更明顯(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　1

23、0.TUNEL-PCNA雙重染色
　　TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞后再行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PCNA陽性細(xì)胞，TUNEL標(biāo)記的陽性表達(dá)為棕黃色，PCNA標(biāo)記的陽性表達(dá)為紫色。圖像形象顯示高血壓小動(dòng)脈血管壁細(xì)胞凋亡陽性細(xì)胞和PCNA陽性細(xì)胞都明顯增多，而小動(dòng)脈血管壁細(xì)胞凋亡占優(yōu)勢(shì)、大動(dòng)脈血管壁細(xì)胞增生趨勢(shì)更明顯。
　　研究結(jié)論：
　　1.高血壓小動(dòng)脈存在膠原增生明顯的血管重構(gòu)，以外膜Ⅲ型膠原明顯，伴AF的遷移及表型轉(zhuǎn)化。

24、>　　2.高血壓大血管重構(gòu)血管壁細(xì)胞增生更明顯，以中膜平滑肌細(xì)細(xì)增生為主，符合傳統(tǒng)研究結(jié)果。
　　3.高血壓血管重構(gòu)血管壁細(xì)胞增生和凋亡共同存在，但小動(dòng)脈重構(gòu)以非細(xì)胞成分-膠原增生占重要地位。
　　提示高血壓動(dòng)脈血管重構(gòu)是一個(gè)多因素、多種細(xì)胞、多種病變共同參與的動(dòng)態(tài)病理過程，小血管重構(gòu)存在不同于大血管重構(gòu)的以膠原增生明顯的特征性改變。
　　第二部分葡萄籽原花青素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠小血管重構(gòu)的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　

25、　研究背景：
　　高血壓病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展和血管重構(gòu)(VR)密切相關(guān)。單純的“降壓達(dá)標(biāo)”并不能完全控制靶器官損害和并發(fā)癥的發(fā)生，靶器官損害甚至可以發(fā)生在血壓升高之前，提示高血壓靶器官損害與血壓水平相關(guān)性并不與早期的理論完全相符;因此探討高血壓血管重構(gòu)機(jī)制及其防治，對(duì)保證病人的生命安全、提高人類的生存質(zhì)量以及減輕國(guó)民經(jīng)濟(jì)的壓力意義深遠(yuǎn)。
　　研究表明:活性氧(Reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的氧

26、化應(yīng)激參與了高血壓血管重構(gòu)的各個(gè)環(huán)節(jié)，氧化應(yīng)激(Oxidative Stress)水平增強(qiáng)貫穿高血壓的發(fā)生發(fā)展。氧化應(yīng)激涉及內(nèi)皮功能障礙、炎癥、增生、凋亡、遷移和纖維化，是高血壓血管重構(gòu)重要的觸發(fā)、促進(jìn)因素。
　　GSPE是主要來源于葡萄籽、具有超強(qiáng)抗氧化活性的多酚類化合物，大量研究資料證實(shí)不僅在心血管領(lǐng)域呈現(xiàn)卓越的保護(hù)作用，如抗動(dòng)脈硬化、降壓、降脂，抗心肌缺血再灌注損傷及抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮功能等;新近研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤活性，對(duì)多種

27、腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，但對(duì)高血壓小血管重構(gòu)影響及機(jī)制研究鮮有報(bào)道。
　　本研究第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果已發(fā)現(xiàn)膠原增生在小血管重構(gòu)中的重要地位以及小血管壁細(xì)胞凋亡增多涉及到血管壁細(xì)胞增生和凋亡的失衡并參與小血管重構(gòu)的發(fā)展。在第二部分對(duì)比自發(fā)性高血壓大鼠模型對(duì)照組(SHR-C)及不同劑量GSPE干預(yù)組，檢測(cè)各組動(dòng)物血壓、血脂、血糖、腎功及氧化應(yīng)激水平的變化，并應(yīng)用光鏡、電鏡等觀察其對(duì)小血管重構(gòu)形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及細(xì)胞學(xué)的變化，TUNEL法和PCN

28、A分別檢測(cè)對(duì)血管壁細(xì)胞凋亡與增生情況的變化，探討不同劑量GSPE對(duì)高血壓小血管重構(gòu)能否起到改善作用;進(jìn)一步對(duì)膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1和凋亡相關(guān)蛋白BAX、Bcl-2表達(dá)進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè)，探討GSPE對(duì)高血壓小血管重構(gòu)的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。
　　研究目的：
　　1.研究氧化應(yīng)激水平與高血壓小血管膠原增生重構(gòu)的關(guān)系;
　　2.證實(shí)不同劑量GSPE對(duì)高血壓小血管膠原增生重構(gòu)的保護(hù)作

29、用;
　　3.同時(shí)觀察血管壁細(xì)胞增生和凋亡與GSPE的關(guān)系;
　　4.從分子水平探討GSPE改善高血壓小血管重構(gòu)的作用機(jī)制。
　　研究方法
　　實(shí)驗(yàn)第二部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組、飼養(yǎng)、給藥及標(biāo)本留取如前所述:30只20周齡雄性SHR大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為:模型對(duì)照組（SHR-C組，n=10），GSPE小劑量干預(yù)組（SHR-L組，n=10），GSPE大劑量干預(yù)組（SHR-H組，n=10）。每天清晨SHR-C組給予

30、1ml0.9％生理鹽水灌胃，而GSPE干預(yù)組分別給予100ug/kg，250ug/kg1ml灌胃。22周后用水合氯醛麻醉動(dòng)物后，取血后迅速分離各組大鼠腸系膜小動(dòng)脈組織。
　　1.實(shí)驗(yàn)期間每周尾套法測(cè)量尾動(dòng)脈收縮壓并稱重;
　　2.3組大鼠血樣離心后取血清進(jìn)行總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯及血糖、肌酐、尿素氮的測(cè)定;
　　3.采用Victor1420多功能標(biāo)記儀即MultilabelCounter測(cè)定全部4組大鼠腸系膜

31、小動(dòng)脈組織上清液活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)、過氧化氫(Hydrogenperoxide，H2O2)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)含量。
　　4.留取3組大鼠的腸系膜小動(dòng)脈組織，HE染色觀察腸系膜小動(dòng)脈形態(tài)、天狼猩紅-維多利亞藍(lán)染色檢測(cè)膠原纖維和彈力纖維變化及Ⅰ、Ⅲ型

32、膠原的分布、以間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡分析Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)、通過透射電子顯微鏡觀察3組大鼠腸系膜小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化、TUNEL法和PCNA分別檢測(cè)對(duì)血管壁細(xì)胞凋亡與增生情況的影響。并留取組織凍存于-80℃冰箱，匯總實(shí)驗(yàn)第一部分組織標(biāo)本進(jìn)行RT-PCR和Western Blot檢測(cè)。
　　研究結(jié)果：
　　1.血壓和體重情況
　　在實(shí)驗(yàn)過程中，雖然收縮壓隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)程逐漸升高，SHR-C組與兩個(gè)G

33、SPE干預(yù)組相比，組間收縮壓差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);3組大鼠的體重變化無明顯差異。
　　2.血清血脂及血糖、血肌酐、尿素氮的情況
　　實(shí)驗(yàn)測(cè)得3組間大鼠的血清總膽固醇、低密度脂蛋白、甘油三脂及血糖、血肌酐、尿素氮均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　3.檢測(cè)4組大鼠腸系膜小動(dòng)脈氧化應(yīng)激指標(biāo)
　　與WKY-C組相比，SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈組織中ROS、H2O2、MDA含量顯著升高，SOD、CAT活性顯

34、著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);經(jīng)GSPE干預(yù)后，SHR-H組ROS(P＜0.05)、H2O2及MDA(P＜0.01)降低， SOD(P＜0.01)、CAT(P＜0.05)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而SHR-L組僅ROS、H2O2含量明顯下降(P＜0.05)，且H2O2含量的下降在兩干預(yù)組間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），提示GSPE抑制氧化應(yīng)激呈劑量依賴性趨勢(shì)。
　　4.大鼠腸系膜小動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化
　　4.1.HE

35、染色顯示:SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈呈明顯血管重構(gòu)征象:管壁增厚，管腔狹窄，平滑肌肥大增生，排列紊亂。SHR-L及SHR-H兩組腸系膜血管重構(gòu)征象有所改善，尤以SHR-H組明顯，管壁厚度和管腔狹窄程度明顯減輕，血管內(nèi)膜較光滑，平滑肌增生，排列欠規(guī)則。
　　4.2.天狼猩紅-維多利亞藍(lán)雙染明視野下觀察:SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈壁顯著增厚，管腔狹窄，藍(lán)綠色單層內(nèi)彈力板無明顯增厚，管壁紅色膠原纖維重度增生，主要分布于中膜及外膜;GSP

36、E干預(yù)組有所改善:劑量依賴性地出現(xiàn)管壁變薄、管腔增大，血管壁膠原纖維增生減輕，尤以高劑量組（SHR-H組）明顯。經(jīng)過Olympus DP72光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像采集，Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量檢測(cè)分析顯示:與SHR-C組相比，SHR-H組ID、LCSA明顯增大(P＜0.05)，而WT、WT/ID、WCSA、WCSA/LCSA明顯減?。≒＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義:SHR-L組僅WT、WT/ID、WCSA、WCSA

37、/LCSA明顯減小(P＜0.01)，提示GSPE改善小血管重構(gòu)形態(tài)學(xué)的劑量依賴性趨勢(shì)。
　　5.3組大鼠腸系膜小動(dòng)脈膠原、彈力纖維的比較
　　天狼猩紅-維多利亞藍(lán)雙染明視野下觀察，SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈管壁明顯增厚，管腔內(nèi)徑減少，藍(lán)綠色單層內(nèi)彈力板有所增厚，中膜、外膜紅色膠原纖維重度增生，且排列紊亂，甚至斷裂;而GSPE干預(yù)組劑量依賴性地呈現(xiàn)管壁增厚減輕，管腔內(nèi)徑增大，藍(lán)綠色單層彈力板變化不明顯，血管壁紅色膠原纖維減少，排

38、列仍欠整齊，以高劑量組改善更明顯，但藍(lán)綠色單層彈力板變化不明顯;Image pro-plus圖像分析系統(tǒng)定量檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，GSPE干預(yù)后兩組大鼠腸系膜小動(dòng)脈膠原面積百分比顯著低于SHR-C組大鼠(P＜0.05)，彈性纖維面積百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，膠原纖維面積與彈性纖維面積比值SHR-L組(P＜0.05）、SHR-H組（P＜0.01）均增高;差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.大鼠腸系膜小動(dòng)脈Ⅰ、Ⅲ型膠原分布情況
　　天

39、狼猩紅-維多利亞藍(lán)雙染偏振光顯微鏡暗視野下可見:SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈管壁膠原纖維明顯增生、增粗，排列紊亂，黃紅色增生的Ⅰ型膠原纖維主要分布在外膜并延及中膜，綠色Ⅲ型膠原纖維則彌漫分布于中膜、外膜及外緣;而GSPE干預(yù)組呈現(xiàn)劑量依賴性的血管壁膠原纖維增生減輕，尤以中膜和外膜Ⅲ型膠原纖維減少明顯，中膜內(nèi)Ⅰ型膠原也明顯減少，膠原排列仍欠規(guī)整。
　　7.間接免疫熒光組織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)間接免疫熒光組

40、織化學(xué)染色配合激光掃描共聚焦顯微鏡下可見:SHR-C組腸系膜小動(dòng)脈管壁明顯增厚，綠色膠原增生，紅色細(xì)胞核數(shù)目增多，管腔狹窄，Ⅰ型膠原纖維增多，彌漫性分布于中膜及外膜，Ⅲ型膠原亦增多，主要分布于外膜及外緣;而GSPE干預(yù)組血管壁增厚減輕，細(xì)胞核數(shù)目減少，Ⅰ、Ⅲ型膠原均減少。熒光定量分析(IOD)結(jié)果顯示:與SHR-C組比較，兩GSPE干預(yù)組Ⅰ、Ⅲ膠原的表達(dá)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);SHR-H組較SHR-L組兩種膠原表達(dá)

41、減少更明顯，組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，呈現(xiàn)出劑量依賴性趨勢(shì)。
　　8.透射電鏡觀察3組腸系膜小動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)的變化
　　電鏡下觀察到SHR-C組血管內(nèi)膜損傷嚴(yán)重，部分脫落，并有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)富含擴(kuò)大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的AF遷移至中膜并出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化的特征:細(xì)胞膜下出現(xiàn)密斑，伴隨中膜和外膜中大量膠原蛋白不規(guī)則增生，分布紊亂，AF內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體“空泡化”改變;GSPE干預(yù)組腸系膜小動(dòng)脈內(nèi)膜損傷減輕，膠原蛋白增生有所減輕，呈劑

42、量依賴性的改善，SHR-L組中膜可見遷移細(xì)胞，外膜中可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富的AF。
　　9.TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞
　　TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示:各組大鼠血管壁凋亡細(xì)胞細(xì)胞核染成棕黃色。與SHR-C相比，僅SHR-H組大鼠腸系膜小動(dòng)脈組織凋亡細(xì)胞明顯減少，A0明顯下降（P＜0.01），與SHR-L組間亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），提示GSPE強(qiáng)大的抗凋亡能力及明顯劑量依賴性趨勢(shì)。
　　10.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原

43、(PCNA)
　　PCNA免疫組化染色結(jié)果顯示:增殖狀態(tài)的血管壁細(xì)胞核被染成棕黃色。與SHR-C組相比，僅SHR-H組大鼠腸系膜小動(dòng)脈組織增殖細(xì)胞明顯減少，PI明顯下降（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　11.檢測(cè)4組大鼠腸系膜小動(dòng)脈TGF-β1和膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ的mRNA及蛋白表達(dá)
　　結(jié)果顯示:與WKY-C組大鼠相比，SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈膠原蛋白Ⅰ（P＜0.01）、膠原蛋白Ⅲ(P＜0.05)及TGF-β

44、1（P＜0.01）mRNA表達(dá)均明顯增加;而低劑量和高劑量的GSPE均可以拮抗這些作用，與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1mRNA表達(dá)下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4組大鼠血管壁膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1蛋白的表達(dá)差異與mRNA一致，即SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈膠原蛋白Ⅰ，膠原蛋白Ⅲ及TGF-β1蛋白三種蛋白表達(dá)均高于WKT-C組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而

45、低劑量和高劑量的GSPE均可以拮抗這些作用，與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組膠原蛋白Ⅰ(P＜0.05)，膠原蛋白Ⅲ(SHR-L,P＜0.05.SHR-H, P＜0.01)、TGF-β1(SHR-L,P＜0.05; SHR-H, P＜0.01)蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)高血壓小動(dòng)脈血管重構(gòu)與TGF-β1增強(qiáng)相關(guān)的膠原蛋白嚴(yán)重增生明顯相關(guān)，GSPE干預(yù)可明顯降低TGF-β1蛋白的表達(dá)，改善膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ增生，從而改善

46、小動(dòng)脈血管重構(gòu)。
　　12.檢測(cè)4組大鼠腸系膜小動(dòng)脈Bci-2和Bax mRNA及蛋白表達(dá)
　　結(jié)果顯示:與WKY-C組大鼠相比， SHR-C組大鼠腸系膜小動(dòng)脈Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)，BaxmRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05），Bcl-2與Bax的比值明顯降低（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而低劑量和高劑量的GSPE均可以拮抗這些作用，與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組Bcl-2mR

47、NA表達(dá)增加（SHR-L，P＜0.05;SHR-H，P＜0.01），SHR-H組Bax mRNA表達(dá)減少(P＜0.05)、低劑量組和高劑量組Bci-2與Bax mRNA表達(dá)的比值(SHR-L，P＜0.05; SHR-H，P＜0.01)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4組大鼠血管壁Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)差異與mRNA一致:與WKY-C組相比，SHR-C組Bcl-2的蛋白表達(dá)減少(P＜0.05)，Bax的表達(dá)增加不明顯，但Bcl-2/Bax蛋

48、白表達(dá)的比值降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與SHR-C組相比，SHR-L組和SHR-H組均可以提高Bcl-2蛋白的表達(dá)(P＜0.05)， SHR-H組可降低Bax蛋白的表達(dá)(P＜0.05)，兩組Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)的比值也升高(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。證實(shí)高血壓小動(dòng)脈血管重構(gòu)與高血壓誘導(dǎo)小動(dòng)脈細(xì)胞凋亡增多相關(guān)，低劑量和高劑量GSPE可以通過明顯抑制細(xì)胞凋亡參與高血壓大鼠小動(dòng)脈血管重構(gòu)。
　　結(jié)論：

49、　　1.氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)與高血壓小血管膠原重構(gòu)密切相關(guān)，可能是其原因之一。
　　2.GSPE具有獨(dú)立于降壓作用之外的保護(hù)高血壓小血管重構(gòu)的作用，并呈劑量依賴性趨勢(shì)。
　　3.GSPE改善高血壓小動(dòng)脈重構(gòu)的作用與抑制氧化應(yīng)激/TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)，進(jìn)而抑制AF激活、遷移、表型轉(zhuǎn)化，達(dá)到抑制小血管壁膠原蛋白過度合成、沉積。
　　4.GSPE還通過抑制氧化應(yīng)激減輕高血壓小動(dòng)脈壁細(xì)胞凋亡，參與調(diào)節(jié)增殖/凋亡的平衡相關(guān)的小血