miRNA-9在低氧誘導(dǎo)的腎臟纖維化中的作用研究.pdf

1、目前世界上有超過5億人患有慢性腎臟疾病，并且每年超過百萬人死于慢性腎臟病導(dǎo)致的心腦血管并發(fā)癥。所以，目前慢性腎臟病成為繼心腦血管病、腫瘤、糖尿病之后又一個(gè)威脅人類健康的疾病，從而成為全球性公共衛(wèi)生問題。腎臟纖維化是慢性腎臟病的共同特征，也是進(jìn)展至終末期腎病的共同病理過程。所以，研究腎臟纖維化的機(jī)制意義重大。
　　miRNA是近年來的研究熱點(diǎn)，其中miRNA-9在腫瘤的EMT、組織及器官的纖維化中發(fā)揮重要的作用。既往研究顯示組織缺氧

2、能夠促進(jìn)細(xì)胞EMT，并且能夠促進(jìn)腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移。除此之外，低氧亦在腎臟EMT及纖維化中發(fā)揮著舉足重輕的作用。那么，miRNA-9在低氧誘導(dǎo)的腎臟纖維化中是否發(fā)揮一定的作用？
　　E-cadherin是一種由CDH1基因編碼的細(xì)胞表面糖蛋白。其能夠調(diào)節(jié)鈣依賴的細(xì)胞間連接，并且參與細(xì)胞的分化及形態(tài)改變。但是其在腎臟纖維化中研究較少。通過生物信息學(xué)預(yù)測，我們發(fā)現(xiàn)CDH1可能是miRNA-9的靶基因之一。那么，E-cadherin是否參

3、與低氧誘導(dǎo)的腎臟纖維化呢？它與miRNA-9存在著怎樣的關(guān)系呢?對上述問題目前仍不清楚。
　　目的：
　　1.研究HK-2細(xì)胞在低氧刺激后，miRNA-9、E-cadherin、纖維化分子的表達(dá)情況；
　　2.研究miRNA-9在HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；
　　3.研究E-cadherin在HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；
　　4.研究miRNA-9與E-cadherin之間的關(guān)系；
　　5.研究m

4、iRNA-9、E-cadherin在大鼠UUO模型及IgA腎病中的表達(dá)。
　　方法：
　　1.HK-2細(xì)胞在低氧孵箱中培養(yǎng)不同時(shí)間，通過qRT-PCR和Western blot方法，檢測miRNA-9、E-cadherin和纖維化分子的表達(dá)；
　　2.用miRNA-9 mimic和inhibitor分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使miRNA-9過表達(dá)和抑制，觀察其在HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；
　　3.用E-cadherin慢

5、病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染建立過表達(dá)細(xì)胞系，并用siRNA轉(zhuǎn)染建立干擾細(xì)胞系，觀察轉(zhuǎn)染后其在HK-2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換中的作用；
　　4.數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA-9的靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)；
　　5.建立大鼠UUO模型，檢測miRNA-9、E-cadherin在其中的表達(dá)；收集臨床IgA腎病病人腎活檢組織、腎癌病人癌旁腎組織，并檢測miRNA-9、E-cadherin在其中的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.HK-2細(xì)胞置于1

6、％O2的孵箱中分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h，qRT-PCR及Western blot方法檢測miRNA-9、E-cadherin、纖維化分子的表達(dá)，結(jié)果顯示：miRNA-9、纖維化分子的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸升高，E-cadherin逐漸降低。說明低氧刺激可促進(jìn)HK-2細(xì)胞纖維化。
　　2.miRNA-9 mimic、inhibitor分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染，qRT-PCR及Western blot方法檢測miRNA-9、

7、E-cadherin、纖維化分子的表達(dá)，結(jié)果顯示：miRNA-9mimic轉(zhuǎn)染后，纖維化分子的表達(dá)增加，E-cadherin表達(dá)減少；miRNA-9 inhibitor轉(zhuǎn)染后，E-cadherin表達(dá)增加，纖維化分子的表達(dá)減少。說明miRNA-9可促進(jìn)HK-2細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　3.E-cadherin過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR及Western blot方法檢測E-cadherin、及纖維化分子的表達(dá)，結(jié)果顯示：E

8、-cadherin的表達(dá)升高，纖維化分子的表達(dá)降低；siRNA轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR及Western blot方法檢測E-cadherin、纖維化分子的表達(dá)，結(jié)果提示：E-cadherin的表達(dá)減少，纖維化分子的表達(dá)增加。說明E-cadherin可抑制HK-2細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。
　　4.Target Scan軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)CDH1可能為miRNA-9的下游靶基因之一，雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miRNA-9可以與CDH1的3'UTR

9、相結(jié)合。
　　5.在大鼠UUO模型中，miRNA-9的表達(dá)明顯升高，E-cadherin的表達(dá)顯著下降；與癌旁正常腎組織相比，IgA腎病病人活檢腎組織中，miRNA-9的表達(dá)明顯增加，E-cadherin的表達(dá)顯著減少。
　　結(jié)論：通過研究低氧刺激后的HK-2細(xì)胞中、UUO模型中、IgA腎病病人中miRNA-9、E-cadherin的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)低氧刺激后HK-2細(xì)胞、UUO模型、IgA腎病病人活檢樣本中miRNA-9的表