腸道菌群對(duì)腫瘤免疫微環(huán)境中抗原提呈細(xì)胞功能的影響.pdf

1、【背景】越來(lái)越多的研究證據(jù)表明，腸道菌群參與調(diào)節(jié)了機(jī)體的多種生理和疾病過(guò)程，是以往研究所忽視的一個(gè)重要“器官”。人體的腸道細(xì)菌數(shù)量達(dá)到1013級(jí)別，幾乎等同于自身體細(xì)胞的數(shù)量。由600多種共生細(xì)菌構(gòu)成的腸道菌群的結(jié)構(gòu)和代謝狀態(tài)極容易受到飲食，抗生素等因素的影響。而腸道菌群的差異會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生不同的作用，從而影響到炎性腸病，糖尿病，自身免疫性疾病，甚至自閉癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展。新近的研究結(jié)果提示，一些特定的化療和免疫療法對(duì)腫瘤的治療效應(yīng)依賴

2、于完整腸道細(xì)菌的存在，提示腸道菌群和遠(yuǎn)端腫瘤之間存在一定的聯(lián)系。雖然免疫系統(tǒng)是介導(dǎo)腸道菌群和腫瘤間聯(lián)系的首要考慮途徑，但是對(duì)于腸道菌群中參與調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的細(xì)菌或成分，以及介導(dǎo)腸道菌群對(duì)腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生影響的免疫細(xì)胞類型和具體的調(diào)節(jié)機(jī)制，現(xiàn)有研究未能提供清晰的理解。而對(duì)腸道菌群影響腫瘤免疫微環(huán)境的方式和具體機(jī)制的研究，一方面可從整體系統(tǒng)的角度為免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制提供新的理解，同時(shí)對(duì)以腸道菌群為靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境的新型

3、治療方式有著重要意義。
　　【目的】通過(guò)廣譜抗生素剔除小鼠腸道菌群，觀察腸道菌群缺失對(duì)小鼠抗腫瘤免疫功能的影響，發(fā)現(xiàn)參與介導(dǎo)菌群對(duì)腫瘤免疫監(jiān)視功能影響的免疫細(xì)胞類型，研究潛在菌體成分對(duì)參與介導(dǎo)的免疫細(xì)胞的具體影響和調(diào)控方式。
　　【實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果】
　　1.聯(lián)合抗生素對(duì)小鼠腸道菌群的影響
　　方法：廣譜抗生素Ampicillin, Neomycin, Vancomycin聯(lián)合（ABX）飲水處理小鼠，觀察處理對(duì)小鼠

4、消化道外觀的影響，檢測(cè)抗生素處理前，處理后，撤出抗生素后小鼠糞便中細(xì)菌YCFA培養(yǎng)基培養(yǎng)后CFU數(shù)量，鱟試劑顯色法檢測(cè)血清LPS水平，16s rDNA測(cè)序分析腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性。
　　結(jié)果：ABX飲水處理可將C57BL/6小鼠腸道可培養(yǎng)細(xì)菌降低至1 CFU/100 mg以下，破壞腸道細(xì)菌的結(jié)構(gòu)，使擬桿菌門(mén)的比例大幅降低而厚壁菌門(mén)細(xì)菌比例顯著升高，同時(shí)使腸道菌群的多樣性下降，血液中的LPS濃度下降；抗生素剔除腸道細(xì)菌后盲腸外觀膨大

5、，與無(wú)菌動(dòng)物類似；撤出抗生素后，腸道細(xì)菌的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、多樣性以及血液LPS水平在6天時(shí)間內(nèi)逐漸恢復(fù)，其中血液LPS水平在撤出抗生素后3天即完全恢復(fù)。
　　2.抗生素剔除菌群對(duì)小鼠抗腫瘤免疫功能的影響
　　方法：在腫瘤接種前后不同的時(shí)間段給予抗生素飲水處理：預(yù)先2周開(kāi)始聯(lián)合抗生素（ABX）飲水處理至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；抗生素預(yù)先處理而接種腫瘤后停止處理（ABX-Pre）；接種腫瘤后再給予聯(lián)合抗生素的處理（ABX-Post）。與正常飲水對(duì)

6、照組比較觀察不同處理對(duì)B16F10皮下接種腫瘤生長(zhǎng)的影響?？股仡A(yù)先處理小鼠，接種腫瘤48小時(shí)后，RT-qPCR檢測(cè)腫瘤中IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35和CD80, CD86和 MHCⅡ表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤局部和脾臟中 CD11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+細(xì)胞比例，ELISPOT法檢測(cè)TRP2刺激后脾細(xì)胞中分泌IFN-γ細(xì)胞頻數(shù)，結(jié)晶紫染色法檢測(cè)脾細(xì)胞和脾臟NK細(xì)胞在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力

7、。
　　結(jié)果：預(yù)先聯(lián)合抗生素（ABX）飲水處理的小鼠接種腫瘤細(xì)胞后發(fā)生腫瘤的速度加快，抗生素預(yù)先處理而接種腫瘤后停止處理（ABX-Pre）的小鼠腫瘤發(fā)生速率也有加快的表現(xiàn)，而接種腫瘤后再給予聯(lián)合抗生素的處理方式（ABX-Post）不能對(duì)后續(xù)接種腫瘤的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。接種后48小時(shí)，抗生素處理小鼠皮下的腫瘤中IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35、CD80、CD86及MHCⅡ的mRNA水平較低?？股靥幚斫M腫瘤浸潤(rùn)

8、的CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD11c+MHCⅡ+細(xì)胞和CD11b+MHCⅡ+細(xì)胞的比例均低于對(duì)照組；同時(shí)，ABX組小鼠脾臟細(xì)胞中上述細(xì)胞的比例也較低，在TRP2抗原刺激后分泌IFN-γ的細(xì)胞頻數(shù)較低，脾臟細(xì)胞和從中分離的NK細(xì)胞在體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)沒(méi)有發(fā)生變化。
　　3.菌體抗原補(bǔ)充對(duì)缺失菌群小鼠抗原提呈細(xì)胞功能的影響
　　方法：皮下荷瘤小鼠模型中腫瘤接種前給予DC注射，腫瘤注射后分別給予LPS或生理鹽水腹腔注

9、射一次；抗生素處理小鼠分別通過(guò)口服和腹腔注射途徑給予LPS，觀察記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。檢測(cè)不同LPS處理途徑對(duì)腫瘤局部IFN-γ、TNF-α、IL-12p40、IL-12p35 mRNA水平，CD11c+MHCⅡ+和 CD11b+MHCⅡ+細(xì)胞比例，以及腸道IL-1β、IL-6、IL-10、F4/80、CD11c、CD11b、MHCⅡmRNA水平的影響。體外培養(yǎng)骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDC）和骨髓來(lái)源單核細(xì)胞（BMMo），加入LPS刺激后流

10、式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞膜表面 CD80、CD86和 MHCⅡ分子的表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-12水平。將加入LPS刺激后BMDC和BMMo及未刺激的對(duì)照組細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)T細(xì)胞增殖和上清IL-2分泌水平。
　　結(jié)果： LPS可增強(qiáng)DC對(duì)小鼠皮下移植腫瘤生長(zhǎng)的抑制。相比于腹腔注射，口服途徑補(bǔ)充 LPS可降低 ABX處理小鼠腫瘤瘤體大小，提高腫瘤局部 IFN-γ, TNF-α,IL-12p40，IL-12p35水平和C

11、D11c+MHCⅡ+和CD11b+MHCⅡ+細(xì)胞比例，LPS灌胃處理組小鼠腸道IL-1β因子及F4/80, CD11c, CD11b, MHCⅡ的mRNA均回復(fù)至對(duì)照水平。LPS可使體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的兩種主要抗原提呈細(xì)胞BMDC和BMMo細(xì)胞膜表面的CD80和CD86表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)兩類細(xì)胞IL-12的分泌。LPS刺激后的BMMC和BMMo和T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，T細(xì)胞增殖增加，上清中IL-2水平較高。
　　【結(jié)論】聯(lián)合抗生素飲水處理可清除小