6-羥多巴胺通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的內(nèi)源性鈣釋放對多巴胺能神經(jīng)元功能及存活的影響及機制的研究.pdf

1、背景
　　帕金森?。≒D）是目前常見的神經(jīng)退行性疾病之一，約影響1％的老年人群[1,2]。PD發(fā)病原因及機制尚不明確，PD的病理特征是黑質(zhì)致密部（SNc）多巴胺能神經(jīng)元的喪失和路易體（LB）的產(chǎn)生，其中路易體（LB）主要是α-突觸核蛋白（α-Syn）的聚集體構(gòu)成[3]。
　　由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡是多巴胺能神經(jīng)元選擇性損失的重要分子機制，ER表面的肌醇1,4,5-三磷酸受體（IP3 Rs）和蘭諾定受體（RyRs），

2、是主要的內(nèi)源性Ca2+釋放通道，在調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但是，這些內(nèi)源性Ca2+釋放通道在PD中的作用及其對功能的影響和DA神經(jīng)元的存活仍然未知。
　　已有研究表明在6-OHDA作用下胞質(zhì)內(nèi)鈣離子升高會引起多巴胺能神經(jīng)元質(zhì)膜鈣離子通道變化等一系列變化，但是對內(nèi)源性鈣釋放以及其對細胞興奮性影響、細胞氧化應(yīng)激和細胞存活的研究較少，對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上兩個通道各自在內(nèi)源性鈣釋放中的重要性研究尚缺乏。
　　目的
　　通過研究6

3、-OHDA誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子釋放以及對黑質(zhì)致密部DA神經(jīng)元興奮性、細胞氧化應(yīng)激以及細胞存活的影響，探討6-OHDA誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下細胞質(zhì)鈣離子變化、細胞興奮性改變和細胞存活變化的機制。為SNc區(qū)多巴胺能神經(jīng)元易損性提供一定的基礎(chǔ)支持。
　　方法
　　1．采用Western-Blot法、鈣成像實驗，檢測6-OHDA對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細胞內(nèi)源性鈣釋放的影響。并通過相應(yīng)的抑制劑和通道阻斷劑的運用探討其機制。
　　2．采

4、用全細胞膜片鉗的方法探討6-OHDA誘發(fā)的胞質(zhì)內(nèi)高鈣對 SNc區(qū)多巴胺能神經(jīng)元電活性的影響。
　　3．利用ROS染色和線粒體形態(tài)染色，探討6-OHDA誘發(fā)的胞質(zhì)內(nèi)高鈣對多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響。
　　4．通過MTT和TUNEL染色，探討6-OHDA誘發(fā)的胞質(zhì)內(nèi)高鈣對多巴胺能神經(jīng)元存活的影響。
　　結(jié)果
　　1． Western-Blot實驗證實6-OHDA可引起多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；鈣成像實驗證明6-OH

5、DA誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會造成神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)性和不可逆性升高，而且這種升高與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上RYR鈣離子通道密切相關(guān)。
　　2．全細胞膜片鉗實驗證實6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度持續(xù)性和不可逆性升高會持續(xù)的和不可逆的影響多巴胺能神經(jīng)元興奮性，而且這種影響與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上RyR鈣離子通道密切相關(guān)。
　　3．ROS實驗和線粒體染色證實6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高會部

6、分參與神經(jīng)元氧化應(yīng)激狀態(tài)的誘發(fā)，而且這種影響與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)、細胞胞質(zhì)內(nèi)高鈣濃度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上RyR鈣離子通道密切相關(guān)。
　　4．MTT實驗和TUNEL染色證實6-OHDA誘導(dǎo)的神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高會誘發(fā)多巴胺能神經(jīng)元死亡，而且這種影響與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上RYR鈣離子通道密切相關(guān)。
　　結(jié)論
　　1．細胞功能的研究中，6-OHDA可以誘發(fā)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子外流進入細胞質(zhì)誘發(fā)胞質(zhì)內(nèi)鈣

7、離子濃度升高，而且這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子外流主要和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上RyR鈣離子通道有關(guān)。
　　2．多巴胺能神經(jīng)元興奮性的研究中，6-OHDA可以誘發(fā)的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高，會降低SNc區(qū)多巴胺能神經(jīng)元的興奮性。
　　3．6-OHDA致多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的研究中，6-OHDA可以誘發(fā)的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高部分的參與了6-OHDA導(dǎo)致的多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激。
　　4．6-OHDA可以誘發(fā)的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度升高參與了6-OHDA的細