小鼠脊髓水平TRPM2信號途徑調(diào)節(jié)慢性炎性痛的表觀遺傳機制研究.pdf

1、目的：探討M型瞬時受體電位通道2（TRPM2）介導(dǎo)的小鼠慢性炎性痛及其表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制。
　　方法：第一階段：考察AGK2對小鼠慢性炎性痛的影響，野生型小鼠和TRPM2-/-小鼠，根據(jù)AGK2的劑量（0.2μg/kg、1μg/kg、5μg/kg、25μg/kg）隨機分為6大組（n=6），即：C57 CON組、C57-CFA組、C57-CFA-AGK2組；TRPM2-/-CON組、TRPM2-/- CFA組、TRPM2-/--CF

2、A-AGK2組；每組再據(jù)性別不同，進一步分成2個亞組（a.雄性, b.雌性）。手術(shù)前1日測定每組小鼠的基礎(chǔ)機械縮足閾值（MWT）、冷縮足潛伏期（CPWL）、熱縮足潛伏期（PWL）、足爪腫脹度，手術(shù)后3～9日連續(xù)鞘內(nèi)注射相應(yīng)劑量的AGK2，每日2次，注射時間為早晚八點，同時在手術(shù)后1，3,5,7,9日測定各組小鼠的行為學(xué)。第二階段：考察SAHA對小鼠慢性炎性痛的影響，將野生型（C57）小鼠和TRPM2-/-小鼠，按隨機對照原則分為6組：C

3、57對照組（C57 CON組）、C57炎性痛組（C57 CFA組）、C57炎性痛+辛二酰苯胺異羥肟酸組（C57 SAHA組）、TRPM2-/-對照組（TRPM2-/-CON組）、TRPM2-/-炎性痛組（TRPM2-/-CFA組）、TRPM2-/-炎性痛+辛二酰苯胺異羥肟酸組（TRPM2-/- SAHA組）,每組6只。采用完全弗氏佐劑（CFA）40μl于小鼠左后肢足底皮下注射建立慢性炎性痛模型，SAHA處理組于造模后3～9 d行為學(xué)測試

4、后鞘內(nèi)注射50 mg/kg的SAHA,其它4組注射等量生理鹽水。分別測定小鼠的機械刺激傷害感受閾、輻射熱刺激傷害感受閾、冷痛閾及足爪腫脹度。第三階段：熒光定量PCR分析SIRTs基因的差異性表達，免疫熒光雙標和激光共聚焦法檢測SIRT2/TRPM2蛋白的共表達情況，蛋白印跡法（western bloting）分析各組小鼠SIRT2下游信號途徑CREB蛋白的表達。
　　結(jié)果：第一階段實驗結(jié)果：疼痛行為學(xué)：CFA誘導(dǎo)的慢性炎性痛C57

5、小鼠造模后，與對照組比較，PWL、CPWL、MWT及足爪腫脹度均呈顯著下降（P＜0.001），給予AGK2治療后，小鼠疼痛行為的改善與AGK2的給藥濃度呈顯著的正相關(guān)；TRPM2-/-小鼠在未造模前表現(xiàn)出正常的疼痛行為學(xué)反應(yīng)，與 C57小鼠沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），造模后3 d，其 PWL、CPWL、MWT及足爪腫脹度略低于TRPM2-/-CON組，但仍顯著高于C57 CFA組（P＜0.001），給予AGK2注射后，小鼠的疼痛行為

6、學(xué)也有明顯改善。第二階段實驗結(jié)果：C57 CFA組的機械刺激傷害感受閾值和熱刺激傷害感受閾值均明顯低C57 CON組（P＜0.001），C57 SAHA組在給予SAHA干預(yù)后，各種疼痛閾值顯著升高，與C57 CFA組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.001）；TRPM2-/-CFA組機械刺激傷害感受閾值和熱刺激傷害感受閾值均明顯高于 C57 CFA組，與 TRPM2-/-SAHA組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。C57 CFA組足爪腫脹度

7、造模后明顯升高，與C57 CON組、C57 SAHA組比較均有顯著差異（P＜0.001）；TRPM2-/-CFA組足爪腫脹度明顯低于C57 CFA組（P＜0.001），與TRPM2-/-SAHA相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。第三階段實驗結(jié)果：造模后，C57小鼠SIRT1，2,4,6,7 mRNA的表達均明顯上升，而SIRT3和SIRT5的mRNA的表達是下降的；在免疫熒光定位分析中，C57 CFA組與TRPM2-/-CFA組的