自噬在羊布魯桿菌Omp31誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥中的可能機(jī)制.pdf

1、1.目的：
　　本研究：
　?、庞貌煌瑵舛萇mp31處理BV-2細(xì)胞6h（文獻(xiàn)報(bào)道誘導(dǎo)自噬的時(shí)間），一是明確Omp31能否誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞自噬，二是確定Omp31誘導(dǎo)自噬的合適濃度。
　?、朴煤线m濃度的Omp31處理BV-2細(xì)胞不同時(shí)間，目的是驗(yàn)證BV-2細(xì)胞發(fā)生自噬的時(shí)間是否和文獻(xiàn)報(bào)道時(shí)間吻合，以便進(jìn)一步研究自噬在BV-2細(xì)胞炎癥中的。
　　⑶用不同濃度的Rapa和3-MA處理BV-2細(xì)胞24h，以確定Rapa

2、誘導(dǎo)自噬的濃度及3-MA抑制自噬的濃度。
　?、扔肙mp31、Rapa及3-MA處理BV-2細(xì)胞，以確定自噬能否通過(guò)調(diào)控NF-κB(P65)通路影響TNF-α的表達(dá)。
　　2.方法：
　　①羊布魯桿菌Omp31誘導(dǎo)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞自噬
　　②(0、0.17、0.5、1.5、4.5、13.5)μg/mL Omp31處理BV-2細(xì)胞6h，用Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B的表達(dá)；RT-qPCR檢測(cè)

3、LC3B mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；透射電鏡觀察BV-2細(xì)胞內(nèi)的自噬體；ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6及IL-10的表達(dá)；
　?、?.5μg/mL Omp31處理BV-2細(xì)胞(0、6、12、24)h，用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3B的含量；RT-qPCR檢測(cè)LC3B mRNA的相對(duì)表達(dá)水平；透射電鏡觀察BV-2細(xì)胞內(nèi)的自噬體；ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-6及IL-10的表達(dá)。
　?、躉mp31誘導(dǎo)

4、的自噬對(duì)BV-2細(xì)胞NF-κB(P65)通路的作用
　?、?2.5、5、10)μM Rapa、(2.5、5、10) mM3-MA預(yù)處理BV-2細(xì)胞24h，用We stern blot檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3BⅡ蛋白的含量；
　?、轔mp31、Rapa及3-MA處理BV-2細(xì)胞6h，用Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白B eclin-1、LC3B、P62以及NF-κB(P65)通路相關(guān)蛋白IκBα、p-P65、t-P65的表

5、達(dá)；ELIS A法檢測(cè)TNF-α的表達(dá)；RT-qPCR檢測(cè)(Beclin-1、LC3B、TNF-α)mRNA的相對(duì)表達(dá)；透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)自噬體；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)p-P65蛋白入核。
　　3.結(jié)果：
　?、俨煌瑵舛萇mp31處理BV-2細(xì)胞6h，發(fā)現(xiàn)0.5μg/mLOmp31能使LC3B蛋白及m RNA的表達(dá)量增加，與其余各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且能使LC3BⅡ蛋白含量增加(P<0.05)，同時(shí)在透射電鏡下

6、可見(jiàn)較多自噬體；
　?、诟鳚舛冉MTNF-α、IL-6表達(dá)量均較對(duì)照組增加(P<0.05)，0.5μg/mL實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-6表達(dá)量較其他實(shí)驗(yàn)組低(P<0.01)。各實(shí)驗(yàn)組IL-10表達(dá)量較對(duì)照組均降低(P<0.05)，且不具有濃度依賴性；
　　③0.5μg/mLOmp31處理BV-2細(xì)胞不同時(shí)間，結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組LC3B蛋白的表達(dá)及LC3BⅡ蛋白含量較對(duì)照組增加(P<0.05)，6h組LC3BⅡ蛋白含量及LC3Bm

7、RNA表達(dá)量較其余各組增加(P<0.01)，并且在透射電鏡下可見(jiàn)較多自噬體；
　　④各時(shí)間組TNF-α、IL-6表達(dá)量均較對(duì)照組增加(P<0.01)，且具有時(shí)間依賴性，而IL-10表達(dá)量均較對(duì)照組減少(P<0.01)，與時(shí)間無(wú)關(guān)；
　　⑤5μM Rapa預(yù)處理BV-2細(xì)胞后LC3BⅡ蛋白含量較各組均增加(P<0.01)，2.5mM3-MA預(yù)處理 BV-2細(xì)胞能降低 LC3BⅡ蛋白含量，與其余各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.

8、01)；
　?、轔mp31、Rapa和3-MA處理BV-2細(xì)胞，結(jié)果顯示：Omp31和Rapa均能促進(jìn)L C3B及Beclin-1蛋白表達(dá)，亦能促進(jìn)二者mRNA的表達(dá)，且均能增加LC3BⅡ蛋白含量，以上結(jié)果與對(duì)照組結(jié)果相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。3-MA對(duì)LC3B蛋白和mRN A的表達(dá)以及Beclin-1蛋白的表達(dá)無(wú)影響，但較對(duì)照組能降低LC3BⅡ蛋白含量，并且抑制Beclin-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)。Om

9、p31和Rapa都能降低P62蛋白含量，而3-M A則導(dǎo)致P62蛋白含量增加，與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在透射電鏡下可見(jiàn)Omp31和Rapa均能誘導(dǎo)自噬體形成，而3-MA對(duì)自噬體形成有抑制作用。
　?、逴mp31、Rapa及3-MA均能使IκBα和t-P65蛋白含量降低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Omp31能增加p-P65蛋白水平，而Rapa和3-MA都能使p-P65蛋白水平降低，與對(duì)照組相比

10、均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。用免疫熒光技術(shù)檢測(cè) p-P65蛋白入核，可知Omp31能增加胞核內(nèi)p-P65蛋白的含量，而Rapa及3-MA使胞核內(nèi)p-P65蛋白含量減少；
　?、郞mp31與對(duì)照組相比能增加TNF-α表達(dá)量(P<0.01)，而Rapa及3-MA則使TN F-α表達(dá)量降低(P<0.01)。與對(duì)照組相比，Omp31、Rapa和3-MA均能使TNF-α mRNA表達(dá)量降低(P<0.01)。
　　4.結(jié)論：