TM6SF2 E167K多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝病中的作用研究.pdf

1、目的：探討TM6SF2 E167K多態(tài)性在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞HEPA1-6中的作用機(jī)制。
　　方法：（1）利用10%胎牛血清、1%抗生素的低糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HEPA1-6。（2）構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TM6SF2基因E167K野生型、突變型以及空病毒載體的肝癌細(xì)胞HEPA1-6細(xì)胞株。（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。（4）油紅0染色顯示各組細(xì)胞甘油三酯含量變化，全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定各組細(xì)胞

2、內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的含量。（5）Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CyclinD1、p53、P16、P27、P21和Rb，細(xì)胞炎癥因子TNF-β、IL-2、IL-6和IL-8，膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1c）和脂肪酸合成酶（FASN）的蛋白表達(dá)情況。熒光定量PCR檢測(cè)mRN A的表達(dá)情況。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。
　　結(jié)果：（1）突變組與野生組相比，G1期細(xì)胞比例減少（突變型G1期36.26±0.31%

3、VS野生型G1期57.63±0.28%，t值為88.607，P＜0.05)，S期與G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)增加（突變型S期28.41±0.31%VS野生型S期19.54±0.25%，突變型G2/M期35.23±0.14%VS野生型G2/M期25.77±0.51%，t值分別為38.577，9.982，P＜0.05)，突變組與對(duì)照組相比，G1期細(xì)胞比例減少（對(duì)照組G1期58.36±0.21%，t值為97.595，P＜0.05），S期與G2/M

4、期細(xì)胞比例增加（對(duì)照組S期19.31±0.25%，G2/M期25.61±0.36%，t值分別為39.577,29.201，P＜0.05)，野生型與對(duì)照組相比不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與野生型相比，突變組 CyclinD1、p53和 RbmRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加（2.03±0.01VS1.00±0.00,1.88±0.05VS1.48±0.09,1.29±0.06VS1.18±0.01, t值為178.532,6.729,3.1

5、32，P＜0.05)，P27mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（0.56±0.02VS0.82±0.05,t值為8.363，P＜0.05）。與對(duì)照組相比，突變組CyclinD1、p53、Rb mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加（對(duì)照組1.04±0.06，1.37±0.03，1.15±0.03，t值為28.190,15.152,3.615，P＜0.05），P27mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（對(duì)照組0.85±0.05，t值為9.328，P＜0.05）。野生型

6、和對(duì)照組相比不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。P16和P21mRNA的表達(dá)在三組中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。（2）與對(duì)照組相比，突變組炎癥因子IL-2、IL-6 mRNA的表達(dá)明顯增高（1.24±0.07 VS1.00±0.04，1.24±0.10 VS1.01±0.04，t值分別為5.161，3.698，P值均＜0.05），與野生組相比，突變組炎癥因子IL-2、IL-6 mRNA的表達(dá)明顯增高（野生組IL-2：1.00±0.05

7、，野生組IL-6：1.00±0.09，t值分別為4.829，3.089，P值均＜0.05）。突變組炎癥因子 TNF-β mRNA的表達(dá)與對(duì)照組相比不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.04±0.05 VS1.03±0.03，t值為0.297，P＞0.05）。突變組炎癥因子 IL-8 mRNA的表達(dá)與野生組相比不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.17±0.02 VS1.13±0.04，t值為1.550，P＞0.05）。（3）油紅O染色結(jié)果顯示突變組甘油三酯含量較野生組

8、與對(duì)照組明顯增加。突變組的甘油三酯含量較野生組和對(duì)照組明顯升高（0.54±0.02 VS0.20±0.02 VS0.24±0.02，t值分別為20.859，18.405，P值均＜0.01）。與野生型和對(duì)照組相比，突變組SREBP-lc、FASN mRNA表達(dá)量明顯增加（P值均＜0.01），突變組SREBP-lc、FASN蛋白表達(dá)較野生組與對(duì)照組明顯增加（P值均＜0.01）。突變組SREBP-lc與甘油三酯水平均呈正相關(guān)(r=0．913，

9、P＜0.01）。
　　結(jié)論：（1）TM6SF2基因E167K多態(tài)性通過(guò)上調(diào)CyclinD1、p53、Rb的表達(dá)和下調(diào)P27的表達(dá)引起HEPA1-6細(xì)胞周期紊亂。（2）TM6SF2基因E167K多態(tài)性可促進(jìn)炎癥因子IL-2、IL-6的表達(dá)，可促進(jìn)肝損傷的進(jìn)展。（3）TM6SF2基因E167K多態(tài)性可促進(jìn)脂肪合成增加，甘油三酯的合成增加可能通過(guò)脂質(zhì)代謝密切相關(guān)基因SREBP-lc、FASN起作用，此研究為探討非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)