靶向調(diào)控核受體FOXO1預(yù)防膽固醇結(jié)石形成的可行性研究.pdf

1、叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白(Fox家族)是一組進(jìn)化過(guò)程中保守的轉(zhuǎn)錄因子，有100個(gè)以上的成員，其在分化、增殖、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和代謝方面起著很重要的作用。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO有FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6，它們?cè)诓溉閯?dòng)物的代謝和生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵的作用，而FoxO1則與代謝性疾病關(guān)系最為密切。近年來(lái)體外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1去磷酸化后，從細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動(dòng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵因素，并可能影響肝臟中膽固醇向膽囊的轉(zhuǎn)運(yùn)

2、。在代謝研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1在肝臟內(nèi)的過(guò)表達(dá)會(huì)增加甘油三酯的蓄積和減少脂肪酸的氧化。而流行病學(xué)研究表明，高膽固醇血癥與膽石癥并無(wú)正相關(guān)性，而與高甘油三酯血癥有關(guān)。因此，F(xiàn)oxO1在肝臟的過(guò)表達(dá)，可能就是膽固醇結(jié)石形成的機(jī)理所在。代謝綜合征狀態(tài)下，F(xiàn)oxO1的下游分子具有影響脂質(zhì)代謝和糖代謝的作用，其影響過(guò)程在于FoxO1的去磷酸化狀態(tài)。生理濃度的胰島素抑制FoxO1，導(dǎo)致刺激Cyp7a1基因轉(zhuǎn)錄，繼而增加膽汁酸的合成?；谝陨侠碚摚?/p>

3、課題的研究通過(guò)體外FoxO1過(guò)表達(dá)及下調(diào)等途徑，分析研究其下游調(diào)節(jié)膽石成因相關(guān)基因的表達(dá);并應(yīng)用重組FoxO1或發(fā)夾小干擾RNA病毒，建立成年小鼠的體內(nèi)FoxO1過(guò)表達(dá)或下調(diào)的模型，以期揭示FoxO1與膽固醇結(jié)石形成的直接分子機(jī)制。
　　目的:應(yīng)用慢病毒感染技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株，利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株，觀察脂質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)情況。
　　構(gòu)建小鼠FoxO

4、1基因shRNA重組腺病毒載體和FoxO1基因過(guò)表達(dá)重組腺病毒載體，并經(jīng)C57BL/6小鼠體內(nèi)應(yīng)用，分析FoxO1基因參與膽固醇結(jié)石形成的機(jī)制，探討靶向調(diào)控核受體FOXO1預(yù)防膽固醇結(jié)石形成的可行性。
　　方法:
　　一.FOXO1對(duì)人肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的體外研究
　?。ㄒ唬〧OXO1基因的克隆:應(yīng)用PCR技術(shù)從人肝組織克隆FOXO1基因，選用pEZ_Lv203慢病毒作為載體，借助測(cè)序以鑒定結(jié)果。
　?。ǘ﹕h

5、RNA干擾靶點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)與合成:針對(duì)目的基因人FOXO1序列，利用軟件設(shè)計(jì)并合成三對(duì)shRNA干擾靶點(diǎn)序列，送吉瑪生物科技（上海）有限公司合成，測(cè)序鑒定結(jié)果。
　?。ㄈ┻^(guò)表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的建立
　　1.構(gòu)建人FOXO1基因過(guò)表達(dá)重組慢病毒載體:利用PCR技術(shù)從人肝組織克隆FOXO1基因，選用pEZ_Lv203慢病毒載體，送廣州復(fù)能公司合成、包裝并純化pEZ-FOXO1慢病毒。
　　2.穩(wěn)定過(guò)表達(dá)FOX

6、O1的HepG2細(xì)胞株的篩選與鑒定:
　　(1)包裝好FOXO1過(guò)表達(dá)重組慢病毒感染HepG2細(xì)胞，72小時(shí)收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FOXO1 mRNA的表達(dá)情況，Western Blot檢測(cè)FOXO1蛋白表達(dá)情況
　　(2)用1.0μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的HepG2細(xì)胞株，96小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA的蛋白;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FOXO1 mRNA的表達(dá)情況，WesternBlot

7、檢測(cè)FOXO1蛋白表達(dá)情況。
　　(3)培養(yǎng)、收集過(guò)表達(dá)FOXO1的HepG2穩(wěn)定細(xì)胞株，提取總RNA和蛋白;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因mRNA的表達(dá)，對(duì)mRNA表達(dá)有差異的基因，用WesternBlot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)。
　?。ㄋ模┓€(wěn)定低表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的建立
　　1.構(gòu)建人FOXO1基因shRNA重組慢病毒載體:針對(duì)目的基因人FOXO1序列，利用軟件設(shè)計(jì)并合成三對(duì)shRNA干擾靶點(diǎn)序列，送吉瑪生物

8、科技（上海）有限公司合成、包裝并純化FOXO1 shRNA干擾慢病毒。
　　2.穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1的HepG2細(xì)胞株的篩選與鑒定:
　　(1)包裝好FOXO1 shRNA干擾慢病毒感染HepG2細(xì)胞，96小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA和蛋白;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FOXO1 mRNA的表達(dá)情況，Western Blot檢測(cè)FOXO1蛋白表達(dá)情況。
　　(2)用1.0μg/mL的嘌呤霉素篩選慢病毒感染的HepG2細(xì)胞株，9

9、6小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA的蛋白;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FOXO1的mRNA，Western Blot檢測(cè)FOXO1蛋白表達(dá)情況。
　　(3)培養(yǎng)、收集低表達(dá)FOXO1的HepG2穩(wěn)定細(xì)胞株，提取總RNA和蛋白;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各基因的mRNA。對(duì)mRNA表達(dá)有差異的基因，用Western Blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)情況。
　?。ㄎ澹?shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR):根據(jù)PAXgene RNA kit操作說(shuō)明書提取

10、細(xì)胞總RNA，瓊脂糖凝膠電泳或Agilent2100檢測(cè)RNA完整性。按照ABI逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照ABI lifetech Taqman基因表達(dá)分析體系說(shuō)明書在ABI7900上檢測(cè)基因表達(dá)。擴(kuò)增后結(jié)果采用2-△△Ct法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。
　?。￤estern Blot:收集細(xì)胞，加入細(xì)胞蛋白裂解緩沖液，采用超聲破碎細(xì)胞。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。稀釋至相同濃度后上樣，5％濃縮膠電泳80V30mi

11、n，換120V，10％分離膠繼續(xù)電泳60min。400mA轉(zhuǎn)膜120min;5％脫脂牛奶封閉兩小時(shí)后，加一抗過(guò)夜;二抗孵育2h，顯影拍照。采用Image J分析軟件分析結(jié)果。
　　二、FoxO1基因與膽固醇結(jié)石形成的體內(nèi)研究
　?。ㄒ唬〧oxO1基因的克隆:利用PCR技術(shù)從小鼠肝組織克隆FoxO1基因，選用PDC316-MCS2腺病毒載體，構(gòu)建穿梭質(zhì)粒M_3Flag-FoxO1，利用測(cè)序、WesternBlot方法進(jìn)行結(jié)果鑒

12、定。
　　（二）shRNA干擾靶點(diǎn)序列的設(shè)計(jì)與合成:針對(duì)目的基因FoxO1序列，利用軟件設(shè)計(jì)并合成三對(duì)shRNA干擾靶點(diǎn)序列，送吉滿生物科技（上海）有限公司合成，分別插入載體PGMAV-S1腺病毒載體，利用測(cè)序、Western Blot方法進(jìn)行結(jié)果鑒定。
　?。ㄈ┎捎肁dMax系統(tǒng)包裝腺病毒，CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法純化病毒，梯度稀釋法檢測(cè)病毒滴度。
　?。ㄋ模﹦?dòng)物分組與處理:將40只C57BL/6小鼠隨機(jī)分

13、為四組，分別經(jīng)尾靜脈注射對(duì)FoxO1基因的shRNA腺病毒（FOXO1-shRNA組）、針對(duì)FoxO1基因的shRNA空白載體組（shRNA對(duì)照組）、FoxO1基因過(guò)表達(dá)腺病毒（FOXO1-OE組）、FoxO1基因過(guò)表達(dá)腺病毒空白載體組（FOXO1-OE對(duì)照組），給予膽固醇成石飼料喂養(yǎng)。FoxO1干擾對(duì)照組及FoxO1干擾組喂養(yǎng)6周，F(xiàn)oxO1過(guò)表達(dá)對(duì)照組及FoxO1過(guò)表達(dá)組喂養(yǎng)4周后處死。處死前禁食12小時(shí)，自由飲水。
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14、）檢測(cè)標(biāo)本留取:上述各組小鼠用戊巴比妥（4.5mg/100g體質(zhì)量）腹腔注射麻醉，眶周靜脈取血，離心取血清-80℃保存。采用腹部正中切口，暴露膽囊，觀察有無(wú)結(jié)石，結(jié)扎膽囊管切除膽囊于液氮凍存。采集肝臟凍于-80℃保存至檢測(cè)。
　?。┠懼心懝檀肌⒘字湍懼岬臏y(cè)定:取20μL膽汁，加入180μL生理鹽水稀釋10倍，羅氏Modular P全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)。利用Carey表計(jì)算膽固醇飽和指數(shù)(Cholesterol satur

15、ation index，CSI)。
　?。ㄆ撸晒舛縋CR檢測(cè)C57BL/6小鼠肝臟脂類代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)變化，對(duì)于mRNA表達(dá)有差異的基因，用Western Blot檢測(cè)其蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.篩選出穩(wěn)定低表達(dá)FOXO1及過(guò)表達(dá)FOXO1的細(xì)胞株各一株
　　(1)篩選的shRNA慢病毒命名為L(zhǎng)V3-FOXO1-shRNA2。在RNA水平:感染72小時(shí)及96小時(shí)，相對(duì)于空白對(duì)照的相對(duì)表達(dá)量為

16、0.17和0.19;在蛋白水平:感染72小時(shí)及96小時(shí)，相對(duì)于空白的相對(duì)表達(dá)量為0.899和0.848。而過(guò)表達(dá)慢病毒pEX-FOXO1，在RNA水平:感染72小時(shí)及96小時(shí)，相對(duì)于空白相對(duì)表達(dá)量為8.94和6.17;在蛋白水平:感染72小時(shí)及96小時(shí)，相對(duì)于空白相對(duì)表達(dá)量為0.027和1.400。
　　(2)篩選培養(yǎng)96小時(shí)后，LV3-FOXO1-shRNA2 mRNA表達(dá)為空白對(duì)照的0.527(n=3，P＜0.05)，蛋白表達(dá)

17、為空白對(duì)照的0.62(n=3，P＜0.05);pEX-FOXO1mRNA表達(dá)為空白對(duì)照的105.10(n=3，P＜0.05)，蛋白表達(dá)為空白對(duì)照的2.01(n=3，P＜0.05)。
　　2.FOXO1對(duì)CYP7A1及FXR基因表達(dá)的影響
　　FOXO1基因低表達(dá)時(shí)，CYP7A1基因表達(dá)上調(diào)約4倍(t=21.03，P＜0.01)，F(xiàn)XR基因上調(diào)約1.4倍(t=3.047，P＜0.05);FOXO1高表達(dá)時(shí)，CYP7A1基因表達(dá)

18、下調(diào)約4倍(t=21.85，P＜0.01)，F(xiàn)XR基因下調(diào)約0.8倍(t=12.62，P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.成功構(gòu)建FoxO1過(guò)表達(dá)及FoxO1低表達(dá)腺病毒載體
　　(1)FoxO1過(guò)表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)48h后提取蛋白。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示構(gòu)建載體能在293T細(xì)胞表達(dá)，提示載體構(gòu)建成功。
　　(2)構(gòu)建的三個(gè)FoxO1 shRNA干擾腺病毒感染鼠ST2細(xì)胞，培養(yǎng)72h

19、，提取總蛋白。根據(jù)Western blot結(jié)果選擇干擾效果最好的，繼續(xù)擴(kuò)增，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　(3)擴(kuò)增構(gòu)建的腺病毒滴度結(jié)果:獲得滴度為1×1011PFU/mL的FoxO1過(guò)表達(dá)(FoxO1-OE)和FoxO1干擾(FoxO1-shRNA)腺病毒。
　　4.體內(nèi)干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果
　　(1)FoxO1過(guò)表達(dá)組及FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)照組，致石飲食喂養(yǎng)4周后，麻醉處死，觀察膽囊成石情況，取標(biāo)本。FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)照組，4只成石(

20、4/10)，成石率40％;FoxO1過(guò)表達(dá)組，8只成石(8/10)，成石率80％。FoxO1干擾組組及FoxO1干擾對(duì)照組，致石飲食喂養(yǎng)6周后，麻醉處死，觀察膽囊成石情況，取標(biāo)本。FoxO1干擾對(duì)照組，10只成石(10/10)，成石率100％; FoxO1干擾組，2只成石(2/10)，成石率20％。
　　(2)與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組膽囊膽汁總膽固醇明顯下降，總膽汁酸明顯升高，CSI明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。磷脂變化沒(méi)有統(tǒng)計(jì)

21、學(xué)意義，呈降低趨勢(shì)。而FoxO1過(guò)表達(dá)組各指標(biāo)變化呈相反趨勢(shì)。
　　(3)小鼠血清的血脂檢測(cè)結(jié)果顯示:與FoxO1干擾對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TG、GLU及HDLC則沒(méi)有明顯差異。相對(duì)于FoxO1過(guò)表達(dá)對(duì)照組，F(xiàn)oxO1過(guò)表達(dá)組小鼠血清CHOL、LDLC及LDL/HDL均升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TG、GLU沒(méi)有明顯差異。
　　(4)基因相對(duì)表達(dá)量檢

22、測(cè)結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組的基因Cyp7a1和Fxr表達(dá)明顯升高。而FoxO1過(guò)表達(dá)則呈相反結(jié)果。在FoxO1干擾的抗結(jié)石組我們發(fā)現(xiàn)，Cyp7b1、Cyp8b1和Cyp27a1與對(duì)照組相比均呈上升趨勢(shì)，其中Cyp8b1升高明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(5)蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示:與對(duì)照組相比，F(xiàn)oxO1干擾組的蛋白Cyp7a1和Fxr表達(dá)明顯升高。而FoxO1過(guò)表達(dá)組則呈相反結(jié)果。這一結(jié)果與基因研究結(jié)果相一致。

23、>　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建FOXO1低表達(dá)和高表達(dá)慢病毒載體。感染HepG2后，篩選出低表達(dá)FOXO1和高表達(dá)FOXO1的穩(wěn)定細(xì)胞株，構(gòu)建了細(xì)胞模型。
　　2.構(gòu)建了FoxO1低表達(dá)和高表達(dá)腺病毒載體，經(jīng)尾靜脈注射C57BL/6小鼠，成功復(fù)制出低表達(dá)FoxO1和高表達(dá)FoxO1的小鼠模型。
　　3.隨著FOXO1基因表達(dá)水平的變化，CYP7A1和FXR基因的表達(dá)水平發(fā)生改變，而ABCG5、ABCG8、ABCB11等

24、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因沒(méi)有相應(yīng)的改變。提示，F(xiàn)OXO1基因可能通過(guò)影響膽固醇和膽汁酸的代謝而參與膽固醇結(jié)石的形成。體內(nèi)干預(yù)試驗(yàn)結(jié)果也顯示，F(xiàn)oxO1在小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)時(shí)具有一定的促成石作用。FoxO1的shRNA干擾腺病毒，在小鼠具有明顯的抗成石效果。提示FoxO1作為預(yù)防和治療膽囊膽固醇結(jié)石靶點(diǎn)的可行性。
　　4.進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FoxO1基因表達(dá)發(fā)生變化時(shí)，引起Cyp7a1和Fxr基因的表達(dá)改變，而Abcg5、Abcg8、Abcb