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文檔簡介
1、由腸道免疫力低下導致的仔豬在斷奶期死亡給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。腸道免疫系統(tǒng)是由免疫細胞、免疫球蛋白A(IgA)和腸道微生物組成。已有研究表明TNF家族成員之一,淋巴毒素β受體(Lymphotoxinβ receptor)通過對機體IgA的調控在腸道免疫中起關鍵作用。研究表明,淋巴毒素β受體基因(LTβR)敲除小鼠體內(nèi)缺少淋巴組織,IgA含量下降,細菌感染后死亡率增高;相反,LTβR信號通路激活能發(fā)揮抗細菌感染的作用,同時也能改變腸道菌群的
2、組成?;谶@些研究結果,我們推測該基因在豬的腸道免疫中發(fā)揮著重要作用。本研究克隆了豬的LTβR基因CDS,并進行了該基因在不同組織,不同腸段的表達譜研究。進一步,我們檢測到該基因在第二個內(nèi)含子中有一個A-G的突變,并檢測了其在不同豬種中的基因型頻率。為了檢測LTβ R在豬空腸上皮細胞系中的生物學功能,我們利用CRISPR/Cas9技術獲得了LTβR敲除的IPEC-J2細胞系,并對野生型細胞系和敲除細胞系的增殖與凋亡進行了比較。
3、 本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結論如下:
1、分離了豬淋巴毒素β受體(LTβR)基因,其編碼區(qū)序列長度為1515 bp(預測的分子量:45.58kDa;等電點:5.78),編碼421個氨基酸。豬的LTβR編碼序列與小鼠和人的同源性分別是81%和78%。
2、利用RT-PCR方法分析了L邛R基因的組織表達譜,確定其在不同組織中的表達水平。結果表明,豬LTβR基因在不同組織中表達量不同,在肝臟、腎臟、肺、脾及脂肪組織中表達量較高,
4、肌肉組織如背肌、腿肌和心臟中幾乎不表達該基因。在空腸中表達量高于十二指腸。
3、用不同濃度的內(nèi)毒素(LPS)和干擾素γ(IFNγ)處理IPEC-J2細胞14小時后,用QPCR方法檢測LTβR的表達水平,結果表明,用LPS和IFNγ處理,并不能激活和誘導LTβR的表達。
4、擴增出包括外顯子1到外顯子3的基因組序列,并發(fā)現(xiàn)一個位于第二內(nèi)含子的A-G突變位點,用DdeI-PCR-RFLP的方法研究了其在4個品種(大白豬,
5、杜洛克豬,長白豬和民豬)中的基因型頻率。結果顯示,該基因座的基因型頻率在不同品種中存在較大的差異。
5、通過CRISPR/Cas9技術得到LTβR基因敲除的單克隆IPEC-J2細胞系。雙等位基因敲除的效率達到9.38%。
6、挑選9株單克隆細胞株的其中一株,1-10#,進行了RNA水平(RT-PCR)和蛋白水平(Westernblotting)盼檢測。結果表明,在mRNA水平和蛋白水平上,該基因都得到了敲除。進一步,
6、LTβR基因敲除后,它下游通路的基因(VCAM1和IL22)都下調表達。
7、我們用CCK方法檢測了LTβR基因對細胞增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn),LTβR基因敲除顯著地降低了IPEC-J2細胞的增殖能力(P<0.05)。進一步,我們通過流式細胞檢測發(fā)現(xiàn),細胞周期也受到了影響,顯著多的細胞被阻滯在S期,而不能完成細胞周期。
8、最后,HoloMonitor M4實時顯微鏡監(jiān)測分析表明,LTβR基因敲除顯著地促進了細胞的凋亡。
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