microRNA-21參與鍶促細胞成骨分化及外泌體提取方法改良.pdf

1、目的：鍶(Sr)是人體內(nèi)一種重要的微量元素，在元素周期表中與鈣同族，具有相似的化學性質(zhì)。作為骨的重要成分，由于具有促進骨生成和抑制骨吸收的雙重作用，鍶及相關(guān)生物材料在骨質(zhì)疏松治療及骨缺損填充中的應用受到高度關(guān)注，比如雷奈酸鍶廣泛的應用于預防和治療骨質(zhì)疏松。到目前為止，關(guān)于鍶作用機制的探討已經(jīng)深入到分子層次，包括：鍶與細胞膜上的鈣受體或其它受體結(jié)合，激活細胞內(nèi)信號通路，調(diào)節(jié)細胞分化和成熟行為，進而促進骨基質(zhì)的合成等，但鍶具體作用機制，仍需

2、要進一步完善。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA是調(diào)控成骨分化的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，對成骨細胞的分化發(fā)育具有重要調(diào)控作用，包括正性和負性雙重調(diào)節(jié)作用，但miRNA這一重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子是否也在鍶促進成骨分化機制中發(fā)揮作用尚不明確。本課題就鍶促進細胞成骨分化過程中miRNA-21表達變化以及其在鍶促進成骨分化過程中的作用加以探討。外泌體（exosome）是具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的膜源性小囊泡，直徑多介于30-100 nm，可以由多種細胞合成。外泌體內(nèi)含有

3、不同種類的 microRNAs、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、tRNAs、信號分子等生物學活性物質(zhì)，易與鄰近細胞膜發(fā)生融合，將生物學活性物質(zhì)選擇性地遞呈至受體細胞，從而完成信息傳遞，調(diào)節(jié)細胞間的信號傳導，發(fā)揮生物學功能。鍶促進成骨分化過程中，外泌體是否也發(fā)揮重要調(diào)控機制尚不清楚，而獲得高純度、無丟失的外泌體樣本是進一步探尋該機制的研究基礎(chǔ)。因此本課題同時就外泌體提取方法的改良比較進行探討，為外泌體深入研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:一、采用

4、不同濃度（0,1,3,6,9,12 mM）的氯化鍶（SrCl2）溶液對小鼠前成肌細胞C2C12進行成骨誘導72h，MTT法檢測不同濃度鍶對細胞增殖的影響作用，確定適宜的鍶誘導濃度；實驗組以1mM和3mM鍶誘導C2C12細胞，對照組培養(yǎng)條件與實驗組相同，但不加鍶誘導，72h后分別提取細胞總蛋白和總RNA，以蛋白免疫印跡（Western blotting，WB）檢測成骨標志phospho1蛋白表達水平變化，以實時熒光定量PCR法檢測phos

5、pho1以及microRNA-21基因表達情況；同時，實驗組和對照組細胞均培養(yǎng)7d后，進行堿性磷酸酶（ALP）染色；對C2C12細胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor，6h后加入3mM鍶誘導72h，檢測phospho1基因以及蛋白表達情況；以PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002對細胞預處理2h，隨后加入3mM鍶誘導72h，檢測phospho1基因及蛋白表達水平改變。
　　二、分別用ExoQuick試劑盒及改良方法、超速

6、離心法提取血清外泌體。利用透射電鏡對外泌體進行形態(tài)學觀察；樣本進行2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉（BCA）法蛋白定量；Western blotting檢測外泌體表面標志物CD63；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析樣本蛋白表達差異。
　　結(jié)果：一、MTT結(jié)果顯示，低濃度鍶（1,3mM）誘導細胞后，其增殖情況與對照組相比無明顯差異（p＞0.05），而較高濃度的鍶（6,9,12mM）對細胞增殖具有一定的損害

7、作用（p＜0.05），因此本課題采用低濃度鍶誘導 C2C12細胞成骨分化；分別以1mM和3mM鍶對C2C12細胞誘導72h后，phospho1基因和蛋白表達均升高（p＜0.05），且3mM鍶對C2C12細胞的誘導成骨分化作用較1mM鍶明顯；同時檢測小RNA miR-21發(fā)現(xiàn)，其表達也較對照組明顯上調(diào)（p＜0.05）；對C2C12細胞進行miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染后，鍶促進成骨作用消失，phospho1基因以及蛋白表達明顯下調(diào)（

8、p＜0.05）；以PI3K/AKT通路抑制劑LY294002對細胞預處理后，同樣抑制了鍶對C2C12的誘導成骨作用，phospho1基因和蛋白表達水平下降。
　　二、ExoQuick試劑盒及改良方法、超速離心法均可獲得血清 exosome，電鏡下可觀察到圓形或橢圓形膜性囊泡結(jié)構(gòu)；傳統(tǒng)超速離心法提取樣本蛋白濃度顯著低于ExoQuick試劑盒法及其改進方法（P＜0.05）；SDS-PAGE顯示三種方法提取樣本蛋白表達強度及豐度存在差異

9、；western blotting表明三種方法提取的外泌體均表達表面特異性標志物 CD63，且含同濃度蛋白的情況下，ExoQuick Precipitation及改良法其CD63含量明顯高于傳統(tǒng)超速離心法。
　　結(jié)論：一、低濃度的鍶對細胞無明顯毒性且具有明顯的促成骨作用。結(jié)果表明，鍶可通過上調(diào)miR-21促進PI3K/AKT通路活化以促進促成骨因子phsopho1的表達促進細胞成骨。
　　二、ExoQuick試劑盒及改良方法