腫瘤源性IL-35促進(jìn)CCL5分泌招募單核細(xì)胞.pdf

1、目的：
　　IL-35是一種新發(fā)現(xiàn)的屬于 IL-12細(xì)胞因子家族的異源二聚體。它含有 EB病毒誘導(dǎo)的基因EBI3和IL-27 P35兩個亞基。IL-35具有直接抑制T細(xì)胞增殖的免疫抑制的潛力，并且能夠?qū)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉置贗L-35的rIL35Treg細(xì)胞，正是由于IL-35如此強大的免疫抑制功能，并且已研究表明其不只是在T細(xì)胞中表達(dá)，在 B細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，那么，在機(jī)體任何疾病發(fā)生的原因必然與免疫微環(huán)境的失調(diào)有關(guān)，

2、正常的免疫微環(huán)境需要促炎及免疫抑制因子的相平衡，任何一方的失調(diào)，即失平衡，必然引起疾病的發(fā)生，對于腫瘤來說，免疫微環(huán)境的改變不但可以成為其發(fā)生因素，在其發(fā)生之后，腫瘤細(xì)胞自身將會產(chǎn)生和分泌相關(guān)的細(xì)胞因子等來引起免疫微環(huán)境的進(jìn)一步改變，于此之間的相互作用，必然引起腫瘤的進(jìn)一步發(fā)生及發(fā)展?，F(xiàn)已證實IL-35參與多種疾病的形成過程，包括各種炎癥性疾病、冠狀動脈疾病和癌癥，在炎癥性及免疫性相關(guān)疾病中，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘等均有相當(dāng)多的研究報

3、道，但是在腫瘤中對IL-35的研究還很少，我們在前期工作中研究發(fā)現(xiàn)IL-35在胰腺癌組織中及細(xì)胞系內(nèi)均有高表達(dá)，因為胰腺癌是一個含有豐富間質(zhì)成分的實體瘤，在其中炎性細(xì)胞占有很大比重，巨噬細(xì)胞是其中的主要細(xì)胞亞群，雖然IL-35與T細(xì)胞的相關(guān)性已經(jīng)較為透徹，那么作為炎癥細(xì)胞重要參與者的巨噬細(xì)胞，還沒有過研究報道IL-35與之的相關(guān)性，本研究就在前期預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)了IL-35的表達(dá)水平跟腫瘤中局部浸潤的單核/巨噬細(xì)胞數(shù)具有相關(guān)性，并且已經(jīng)有大

4、量研究證實了巨噬細(xì)胞在腫瘤轉(zhuǎn)移、進(jìn)展和血管生成等過程中是一個重要的調(diào)節(jié)因子，因此本文為進(jìn)一步明確 IL-35招募單核/巨噬細(xì)胞的途徑進(jìn)行研究，將會對腫瘤的研究進(jìn)展起到極大的推動作用，并且為臨床的用藥提供新的可能。
　　內(nèi)容和方法：
　　一、胰腺導(dǎo)管腺癌中IL-35的表達(dá)及與局部浸潤單核巨噬細(xì)胞的關(guān)系
　　1.在組織水平的免疫組化染色中，請病理科專業(yè)人員對片子的染色程度進(jìn)行評分，評級，最后結(jié)果輸入SPSS系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計分析

5、，得出IL-35的表達(dá)水平是否與局部浸潤單核巨噬細(xì)胞數(shù)就有相關(guān)性，并且統(tǒng)計單核巨噬細(xì)胞數(shù)的水平與患者的預(yù)后是否相關(guān)。
　　2.在癌癥基因組數(shù)據(jù)庫（The Cancer Genome Atlas,TCGA）平臺，分析IL-35與單核細(xì)胞相關(guān)Marker的相關(guān)性，進(jìn)一步可以在胰腺癌組織的mRNA水平證實IL-35與單核巨噬細(xì)胞的相關(guān)性；
　　二、探究IL-35招募單核/巨噬細(xì)胞的途徑
　　1.對過表達(dá)IL-35的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

6、進(jìn)行測序結(jié)果分析，查看IL-35的表達(dá)升高能夠引起哪些與招募單核/巨噬細(xì)胞相關(guān)的趨化因子在基因水平的改變；
　　2.在 TCGA數(shù)據(jù)庫平臺進(jìn)一步證實 IL-35與單核/巨噬細(xì)胞相關(guān)的趨化因子是否具有潛在可能的相關(guān)性；
　　3.利用qRT-PCR，Western-blot兩個實驗來驗證，在細(xì)胞mRNA及蛋白水平上IL35是否與單核巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子間存在潛在的關(guān)聯(lián)性；
　　4.如果IL-35與單核巨噬細(xì)胞相關(guān)的趨化因子

7、間存在相關(guān)性，那么證實在機(jī)制水平上，IL-35能夠調(diào)控相關(guān)趨化因子是必須的，因此，我們利用，IL-35重組蛋白的刺激，加入相關(guān)受體的阻斷，觀察趨化因子是否會跟隨發(fā)生相關(guān)的改變，即Western-blot來驗證IL-35促單核巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子分泌的分子機(jī)制；
　　5.為了確切得證實其相關(guān)性，那么需要證實在IL-35重組蛋白的刺激下，信號通路是否可以如何與趨化因子的啟動序列區(qū)域的開放閱讀框架相結(jié)合，因此用 CHIP來驗證 IL-3

8、5是否能夠和單核巨噬細(xì)胞相關(guān)趨化因子的啟動子區(qū)相結(jié)合，是其之間的調(diào)控更加明確。
　　三、體外功能實驗來驗證IL-35是通過相關(guān)趨化因子來對單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的招募作用
　　1.在機(jī)制上走得通，但是必須通過體外功能實驗來進(jìn)一步的確切，采用密度梯度離心法來分離得到外周血單個核細(xì)胞，再并用貼壁法對巨噬細(xì)胞進(jìn)行純化，進(jìn)行得到相對純化的巨噬細(xì)胞；
　　2.用Transwel實驗來驗證穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系上清對單核巨噬細(xì)胞的招募作用，由于IL

9、-35的改變引起下游趨化因子的改變，那么會分泌到細(xì)胞的培養(yǎng)上清中，用氣來檢測對巨噬細(xì)胞的招募能力，并且對結(jié)果中巨噬細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計，再進(jìn)行統(tǒng)計分析，查看有無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　四、體內(nèi)動物實驗來驗證IL-35通過相關(guān)趨化因子對單核巨噬細(xì)胞的招募作用。
　　1.小黑鼠皮下種植Pan02過表達(dá)及降表達(dá)IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系及選擇性去除相關(guān)趨化因子及單核細(xì)胞組；
　　2.密切觀察小鼠腫瘤大小及小鼠狀態(tài)的變化。
　　結(jié)果：

10、
　　一、1.免疫組化的結(jié)果顯示，在組織水平上IL-35的表達(dá)高低與局部浸潤的單核巨噬細(xì)胞數(shù)具有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義，并且單核巨噬細(xì)胞的浸潤程度與患者的預(yù)后密切相關(guān)，胰腺癌組織局部浸潤的單核巨噬細(xì)胞數(shù)增多能夠明顯降低患者的總生存期；2.在TCGA數(shù)據(jù)庫中的胰腺癌組織mRNA水平，用熱圖的形式分析 IL-35兩個亞基與單核巨噬細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性，能夠明顯發(fā)現(xiàn)IL-35的兩個亞基與 CD11b,CD68,CCR2等單核細(xì)胞相關(guān) M

11、arker具有很高相關(guān)性。
　　二、構(gòu)建了胰腺癌過表達(dá)IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（PANC-1,BxPC-3和Pan02）和降表達(dá)IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（MIA-paca-2,CFPAC-1和Pan02）,并送去測序公司進(jìn)行基因測序。1.過表達(dá)IL-35穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的測序結(jié)果表明在過表達(dá)IL-35后與對照組細(xì)胞相比其與趨化因子相關(guān)的基因（CCL20,CCL2,CCL5,CX3CX1）表達(dá)均明顯提高；2.TCGA數(shù)據(jù)分析表明IL-35兩個亞基

12、與CCL2,CCL5兩個趨化因子都具有很高的相關(guān)性；3.qRT-PCR，Western-blot在細(xì)胞水平從mRNA及蛋白兩個方面證實IL-35與CCL2及CCL5的相關(guān)性，結(jié)果證實IL-35與CCL5的相關(guān)性較明顯；4. Western-blot來驗證IL-35促CCL5分泌的分子機(jī)制是JAK-STAT通路，主要是STAT1和STAT4激活，磷酸化為P-STAT1和P-STAT4入核進(jìn)行調(diào)控；5.CHIP進(jìn)一步驗證在IL-35的刺激下

13、，P-STAT1和P-STAT4能否入核與CCL5的啟動子序列進(jìn)行結(jié)合。
　　三、1.采用密度梯度離心法從外周血中獲得單個核細(xì)胞，進(jìn)一步采用貼壁法對單個核細(xì)胞進(jìn)行純化，來獲得相對較純的單核細(xì)胞；2.用Transwell證實IL-35通過促進(jìn)PDAC分泌CCL5來招募單核巨噬細(xì)胞，并將結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結(jié)果有意義。
　　四、動物的體內(nèi)實驗證實，IL-35的過表達(dá)能夠明顯促進(jìn)腫瘤的生長，如果在過表達(dá)IL-35的基礎(chǔ)上阻斷CC

14、L5或者去除單核巨噬細(xì)胞，則瘤體的體積明顯縮小，流式檢測IL-35能夠明顯提高腫瘤內(nèi)浸潤的經(jīng)典單核巨噬細(xì)胞的數(shù)量，如果在過表達(dá)IL-35的基礎(chǔ)上阻斷了CCL5和去除單核巨噬細(xì)胞，則招募的經(jīng)典單核巨噬細(xì)胞數(shù)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：
　　眾所周知，巨噬細(xì)胞對于腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移具有重要作用，因此研究如何阻斷巨噬細(xì)胞被招募至腫瘤微環(huán)境局部將具有重要的研究價值，我們首先在組織水平IL-35的表達(dá)與局部浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)密切相關(guān)，IL