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文檔簡介
1、目的: 本文通過體內(nèi)外實驗觀察氟影響下成骨細胞中刺猬蛋白(Hedgehog, Hh)信號通路分子及其下游成骨相關(guān)因子、凋亡相關(guān)因子的表達變化,討論Hh信號特異性阻斷劑環(huán)巴胺(Cyclopamine, Cycl)的阻斷效果;并檢測氟中毒大鼠骨組織中與骨髓微環(huán)境相關(guān)的細胞因子變化情況,深入探討氟影響大鼠骨骼病變時Hh信號變化與骨形成增強的關(guān)系,為氟骨癥治療靶點的研究提供實驗依據(jù)。
方法: 1、不同濃度的含氟水飼養(yǎng)大鼠6個月,觀察氟
2、斑牙發(fā)生情況及測定尿氟含量,明確氟中毒大鼠模型建立成功后,檢測各組大鼠骨氟含量。光鏡觀察骨組織病理形態(tài)學改變;抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鑒定破骨細胞并計數(shù)。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)檢測各組大鼠血清骨堿性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase, BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosph
3、ataseform5b, TRACP5b)含量;免疫組織化學(Immunohistochemistry, IHC)觀察 Hh信號分子和成骨、破骨相關(guān)因子的定位及表達情況,探討 Hh信號變化與骨形成、骨吸收間的關(guān)系。2、實時熒光定量 PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR, real-time PCR)、IHC和蛋白印跡(Western Blot)檢測氟中毒大鼠骨組織 Hh信號通路中主要因子
4、的mRNA和蛋白表達情況,觀察高低劑量氟對Hh信號變化的影響。3、給予高氟組大鼠Cycl腹腔注射,觀察Cycl阻斷后大鼠氟斑牙、尿氟和骨氟含量、血清BALP含量變化情況。細胞增殖與活性檢測試劑盒(cell counting kit8, CCK8)篩選出體外培養(yǎng)成骨細胞時氟和Cycl的最佳藥效濃度,偶氮偶聯(lián)法(p-nitrophenyl phosphate,pNPP法)測定培養(yǎng)成骨細胞堿性磷酸酶(alkaline phhosphatase
5、, ALP)活性。原位末端轉(zhuǎn)移酶標記法(Transferase-mediated dUTP-bintin, TUNEL)定位并計數(shù)骨組織中凋亡成骨細胞個數(shù);流式細胞術(shù)檢測培養(yǎng)成骨細胞凋亡率。Real-time PCR、IHC和Western Blot檢測動物模型和培養(yǎng)成骨細胞中Hh信號通路主要分子、其下游成骨相關(guān)因子及凋亡相關(guān)因子 mRNA和蛋白表達,進一步探討Cycl對氟暴露下培養(yǎng)的大鼠成骨細胞Hh信號的阻斷效果及對成骨細胞增生的影響
6、。4、Real-time PCR、原位雜交(in situ hybridization, ISH)和IHC檢測氟中毒大鼠骨組織與骨髓微環(huán)境相關(guān)細胞因子的mRNA和蛋白表達,探討氟中毒大鼠骨骼損傷時Hh信號與骨髓微環(huán)境變化的聯(lián)系。
結(jié)果: 1、慢性氟中毒大鼠氟斑牙發(fā)生率、尿氟和骨氟含量、血清 BALP含量隨染氟劑量的增加而逐漸增加,提示慢性氟中毒大鼠模型建立成功。氟中毒大鼠骨組織呈骨質(zhì)硬化表現(xiàn)。2、氟中毒組大鼠Hh信號通路因子印
7、度刺猬蛋白(Indian hedgehog, Ihh)和音速刺猬蛋白(Sonic hedgehog, Shh)及骨形成相關(guān)因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor2, Runx2)和成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix, Osx)蛋白表達隨染氟程度加重呈逐漸增強。但破骨細胞計數(shù)、血清TRACP5b、骨吸收相關(guān)因子核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for
8、nuclear factor-kappa B ligand, RANKL)和細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)p50蛋白表達則在低氟組升高較高氟組明顯。氟影響下,Hh信號因子變化與骨形成間呈正相關(guān)性。3、氟中毒組大鼠骨組織中 Hh信號通路的配體(Ihh、Shh)、跨膜蛋白(Smoothened,Smo)及核轉(zhuǎn)錄因子神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因同源蛋白1(Glioma-associated oncog
9、ene homolog, Gli1)、Gli2 mRNA和蛋白表達也較對照組表達增強,呈劑量依賴性;跨膜蛋白受體(Ptched1,Ptch1)和核轉(zhuǎn)錄因子 Gli3的mRNA和蛋白表達則在各組間比較無明顯差異。4、應用Cycl阻斷處理后,大鼠氟斑牙發(fā)生率、尿氟和骨氟含量與氟中毒組比較無明顯差異。氟+Cycl處理組大鼠血清BALP含量較氟中毒組降低;培養(yǎng)細胞中,經(jīng)氟和Cycl處理后ALP活性亦降低。Cycl處理后的大鼠骨組織及培養(yǎng)成骨細胞
10、中Ihh、Shh、Smo、Gli1、Gli2 mRNA和蛋白表達較氟中毒組表達減弱,Hh信號通路下游的成骨相關(guān)因子 Runx2和β鏈蛋白(β-catenin)表達也較氟中毒組減弱,Osx則與氟中毒組無明顯差異。5、氟中毒大鼠成骨細胞凋亡陽性率增加,但經(jīng) Cycl處理后變化不明顯;流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,2.5mg/L NaF處理組成骨細胞凋亡率較5mg/L NaF處理組升高更明顯。經(jīng)氟處理后再用Cycl阻斷,細胞凋亡率較加氟處理組升高。體內(nèi)
11、外實驗證實,氟暴露可致大鼠成骨細胞中 B細胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma-2, Bcl-2)表達降低、Bcl-2基因相關(guān)X蛋白(Bcl-2 accociated X protein, Bax)表達增強、Bcl-2/Bax比值降低。再經(jīng)Cycl處理后,Bcl-2、Bax表達和Bcl-2/Bax比值與氟中毒組比較變化不大。體外實驗則顯示,與氟處理組比較,氟+Cycl處理后Bcl-2表達增強、Bax表達降低、Bcl-2/Bax比
12、值升高。6、轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-6可在慢性氟中毒大鼠成骨細胞中呈陽性表達,三者的mRNA和蛋白表達隨染氟增加而增強,但 IL-1β和 IL-6在低氟組和高氟組間比較無明顯差異。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)在成骨細胞中未見陽性表達,在巨核細胞中呈弱陽性
13、表達,各組間比較表達強度無明顯變化。骨氟、Ihh表達與TGF-β1、IL-1β和IL-6表達間均呈正相關(guān)性,骨氟、Ihh表達與TNFα表達間無明顯相關(guān)性。
結(jié)論: 1、在一定劑量氟暴露下,大鼠骨形成強于骨吸收,骨組織呈骨質(zhì)硬化表現(xiàn)。BALP可作為一個判斷氟致骨質(zhì)硬化的早期生物學指標。2、氟可刺激大鼠成骨細胞Ihh表達增加,此信號經(jīng)由Smo介導,激活Gli2后將信號轉(zhuǎn)錄入細胞核內(nèi),誘導Runx2表達,使成骨細胞增生、BALP活性
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