MEST-PEG1異常甲基化在自然流產(chǎn)中的研究.pdf

1、目的：研究表明，絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（EVT）向母體子宮蛻膜和血管侵襲能力減弱可能是早期自然流產(chǎn)的發(fā)病原因之一，印記基因MEST/PEG1對早期胚胎發(fā)育起著重要的作用，但其在EVT細(xì)胞侵襲過程中的機(jī)制作用尚不清楚，本課題旨在研究印記基因MEST/PEG1異常甲基化參與的EVT細(xì)胞侵襲過程的調(diào)控，該基因的啟動子DNA甲基化和表達(dá)異?？赡転樵缙谧匀涣鳟a(chǎn)的病因之一。
　　方法：選取2014年4月至2014年5月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科

2、選擇人工流產(chǎn)的自然受孕早期停育絨毛組織14例及自然受孕早孕絨毛15例，選取孕周為6-10周，自然停育絨毛即B超下顯示孕囊內(nèi)無胚芽及原始心管搏動。分別用蛋白印記法（Western blot,WB）及免疫組化法（Immunohistochemistry,IHC）檢測早孕停育絨毛和正常絨毛 MEST蛋白表達(dá)水平及表達(dá)定位；用免疫熒光法（Immunofluorescence,IF）檢測 MEST在人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞株（HTR8/Svneo）和絨毛

3、膜癌滋養(yǎng)細(xì)胞株（JEG-3）中的表達(dá)情況；用WB法檢測MEST特異性小干擾RNA（Specific small interference RNA,siRNA）處理HTR8/Svneo細(xì)胞株后MEST蛋白表達(dá)量，及干擾MEST后HTR8/Svneo細(xì)胞中間質(zhì)型標(biāo)志分子N-鈣粘連蛋白（N-cadherin,N-cad）、波形蛋白（Vimentin）和上皮型標(biāo)志分子E-鈣粘連蛋白（E-cadherin,E-cad）及其上游轉(zhuǎn)錄因子Twist、

4、Snail、Slug的表達(dá)情況。用Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)、四甲基偶氮唑藍(lán)（Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）顯色法、實(shí)時xCELLi-gence細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA）檢測處理后HTR8/Svneo細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力。用早期絨毛外植體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測干擾MEST后對絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞外生性生長的影響。用亞硫酸氫鹽測序聚合酶鏈反應(yīng)（Bisulfite-sequencing polymerase c

5、hain reaction,BSP）檢測MEST在早孕停育絨毛和正常絨毛的甲基化水平。
　　結(jié)果：蛋白印記法、免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測結(jié)果顯示MEST/PEG1蛋白在早孕正常絨毛及侵襲性細(xì)胞株HTR-8/Svneo、HPT-8中高表達(dá)，且主要定位于絨毛EVTs細(xì)胞中，而在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（Cytotrophoblasts,CTBs）和JEG-3細(xì)胞中表達(dá)較低；蛋白印記法檢測顯示特異性小干擾RNA敲低MEST表達(dá)后HTR-8/S

6、vneo細(xì)胞中MEST表達(dá)明顯降低，證明干擾有效。Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示干擾后細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著降低，且實(shí)時xCELLi-gence細(xì)胞分析系統(tǒng)（RTCA）結(jié)果顯示干擾后細(xì)胞遷移能力明顯下降，而MTT實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞增殖能力無明顯變化。絨毛外植體實(shí)驗(yàn)顯示敲低MEST后外植體絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞外生性生長明顯降低。蛋白印記法結(jié)果顯示敲低MEST后HTR-8細(xì)胞中間質(zhì)型標(biāo)志分子N-cad、Vimentin及其上游轉(zhuǎn)錄因子Twis