ROBO4-ARF6信號通路在糖尿病腎病患者腎小球組織的表達(dá)及意義.pdf

1、背景與目的:
　　糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是由糖尿病所引起的嚴(yán)重的腎臟微血管并發(fā)癥，為導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。目前，與降低高血糖措施相比，DKD防治進(jìn)展仍然不理想，尤其對早期微蛋白尿的啟動仍然一籌莫展，因此，早期DKD發(fā)病機制尚需更深入的研究。近來，研究發(fā)現(xiàn)腎小球高通透性(Endothelial/glomerular hyperpermeability)可能是糖尿病視網(wǎng)膜疾病、糖尿病血

2、管病變和糖尿病腎病微量白蛋白尿啟動的重要原因。影響腎小球高通透因素很多，但各種因素通過哪種共同通路或途徑參與其中尚不清楚。已經(jīng)知道高糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物、內(nèi)皮源性的NO產(chǎn)生減少、炎癥及氧化應(yīng)激等多種因素可促進(jìn)腎小球通透性，但腎小球內(nèi)皮細(xì)胞在高糖條件下內(nèi)皮通道的開啟和關(guān)閉關(guān)鍵調(diào)控機制尚不能確定，更談不上DKD高通透性的治療靶點，因此，迫切需要探索其機制。
　　近年ROBO4/ARF6信號通路在血管發(fā)生、血管內(nèi)皮穩(wěn)定和內(nèi)皮遷移中起著

3、重要的調(diào)節(jié)作用。蛋白ROBO家族是一類跨膜蛋白，在哺乳動物中包括4個成員:ROBO1，ROBO2, ROBO3和ROBO4，僅ROBO4特異表達(dá)于血管內(nèi)皮。ROBO4/ARF6信號通路中，ROBO4具有調(diào)節(jié)和穩(wěn)定血管內(nèi)皮的屏障功能，抑制病理性的血管新生，防止過分的血管滲出，而ARF6具有致血管內(nèi)皮通透性增高，增加血管滲出的作用，其主要機制如下:ROBO4通過激活A(yù)RF6的抑制劑GIT，從而抑制ARF6的功能，并進(jìn)一步抑制Rac誘導(dǎo)的肌動

4、蛋白細(xì)胞骨架運動及內(nèi)皮細(xì)胞突出活性，進(jìn)而減緩血管新生和降低血管通透性，新近研究顯示，在糖尿病視網(wǎng)膜血管病變視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞模型中，通過激活ROBO4能緩解糖尿病所致的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，與此同時ROBO4信號通路也能抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)或脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的血管通透性增加及抑制敗血癥和病毒血癥時細(xì)胞因子“風(fēng)暴”引起的血管內(nèi)皮高通透性。既然ROBO4具有血管穩(wěn)定作用，且該作用在視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中達(dá)到證實，那么我們有理由推測R

5、OBO4/ARF6信號通路在糖尿病腎病中也同樣參與了腎小球內(nèi)皮細(xì)胞高通透性，進(jìn)而參與了腎小球的血管病理損傷和尿蛋白的進(jìn)展。
　　為此，本研究通過觀察早、中、晚DKD患者腎活檢組織中腎小球ROBO4及ARF6的表達(dá)變化，并分析與蛋白尿、血清肌酐、eGFR、糖化血紅蛋白的相關(guān)性進(jìn)行分析，探討ROBO4/ARF6是否參與了DKD內(nèi)皮高通透性和蛋白尿的啟動，并從內(nèi)皮通透性的穩(wěn)定及減少蛋白尿的滲出角度為DKD的治療尋找關(guān)鍵治療靶點提供一定的

6、理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　臨床資料:收集2012年9月至2015年2月第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科收治的DKD的患者30例和10例正常腎組織標(biāo)本。根據(jù)Mogensen等制定的DKD臨床分類標(biāo)準(zhǔn)及Tervaert等制定DKD病理分期標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為早、中、晚期組。DKD患者早、中、晚期組各10例，其中男性20例，女性10例;對照組腎活檢標(biāo)本取自我院腎癌經(jīng)病理檢查確定為正常的腎組織，男性7例，女性3例。臨床指標(biāo)的收集來源于患者腎

7、活檢及腎癌切除術(shù)前近期的病史資料。其中eGFR(the estimate glomerular filtrationrate，eGFR)根據(jù)Cockcroft-Gault的計算公式測出:eGFR[ml/(min/1.73 m2)]=[(140-年齡)（歲）]×體重(kg)/72× Scr(mg/dl)×性別（男性=1，女性=0.85）。
　　在光學(xué)顯微鏡下觀察切片，每張切片隨機選取5個高倍鏡視野(×400)，使用Image-Pro

8、 Plus6.0彩色圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化半定量分析測定感興趣區(qū)域ROBO4和ARF6的累積光密度值(IOD)，取平均值來反映樣本的指標(biāo)表達(dá)量。
　　統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以以x±s表示，四組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較則使用LSD-t檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　研究病例的臨床及實驗室數(shù)據(jù)
　　早、中、

9、晚期DKD組各10例，共30例，其中男性20例，女性10例，各組年齡差異無
　　統(tǒng)計學(xué)意義。DKD組HbA1c、24h尿白蛋白量、血肌酐水平和eGFR均高于正常對照組;隨著DKD病理分期的增加，HbA1c、24h蛋白尿、血肌酐水平均逐漸增加，而eGFR逐漸降低。
　　各組腎小球組織中ROBO4與ARF6蛋白的表達(dá)
　　免疫組化結(jié)果顯示:對照組ROBO4在GEnCs中有豐富表達(dá)，而ARF6表達(dá)較少;ROBO4主要在GEn

10、Cs中表達(dá)，而ARF6在GEnCs和腎小管上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。與正常組相比，DKD組ROBO4陽性強度顯著降低，且隨病理分期的加重陽性強度逐漸降低(p＜0.05);相反，隨著DKD病理分期的加重，ARF6在DKD早、中期陽性強度明顯增高，僅在晚期相對中期組增高幅度有所回落(p＜0.05)，提示ROBO4在DKDGEnCs中低表達(dá)，而ARF6高表達(dá)。
　　DKD患者腎小球內(nèi)皮細(xì)胞ROBO4、ARF6與其臨床參數(shù)相關(guān)性
　　相關(guān)

11、性分析結(jié)果顯示:ROBO4在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與性別、年齡無顯著相關(guān)性(p＞0.05)，但與24h蛋白尿(r=-0.840，p＜0.01)、血清肌酐(r=-0.689，p＜0.01)、HbA1c(r=-0.660，p＜0.01)呈負(fù)相關(guān)，與eGFR(r=0.589，p＜0.01)呈正相關(guān);ARF6在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)與血清肌酐、eGFR無顯著相關(guān)性(p＞0.05)，與24h蛋白尿(r=0.603，p＜0.01)、糖化血紅蛋白(r