基因編輯技術(shù)介導(dǎo)的基因刪除與替換.pdf

1、基因編輯是一項(xiàng)旨在對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾的新技術(shù)，通過(guò)人工構(gòu)建工程化的核酸酶，對(duì)基因組目標(biāo)區(qū)間序列特異性識(shí)別與切割，定點(diǎn)切割產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double-stranded breaks，DSBs)并通過(guò)細(xì)胞內(nèi)源的同源重組(homologous recombination，HR)或非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)DNA損傷修復(fù)機(jī)制，可以在細(xì)胞活體基因組DNA序列中產(chǎn)生堿基缺失、插入、替換等修

2、飾的技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)具有定向突變、效率高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，使其在基因功能鑒定和遺傳改良應(yīng)用上有著重要的意義。基因刪除是指引入兩個(gè)DSBs，基于NHEJ修復(fù)將兩個(gè)分開(kāi)的DSBs連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)DSBs之間基因片段的刪除?；蛱鎿Q是在基因刪除的基礎(chǔ)上，提供修復(fù)模板，基于HR途徑可以實(shí)現(xiàn)任何設(shè)計(jì)的DNA序列的引入。microRNA(miRNA)是由具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的pri-miRNA加工而來(lái)的一類小分子RNA，參與生物體轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平

3、基因的調(diào)控。基因刪除可被用于創(chuàng)制miRNA無(wú)義突變體以研究其基因功能。本研究基于成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)的基因編輯技術(shù)在植物中實(shí)現(xiàn)基因刪除和基因替換，主要研究結(jié)果如下:
　　1.基因刪除技術(shù)體系的建立。以AtMIR169a、AtMIR827a基因座pri-miR169a和pri-miR827a兩

4、端序列為目標(biāo)區(qū)域，選取靶位點(diǎn)，構(gòu)建基于雙元向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)介導(dǎo)的CRISPR/Cas9編輯載體。
　　2.基因刪除突變體篩選、鑒定與表型分析。通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)篩選基因刪除突變體，得出AtMIR169a、AtMIR827a基因座pri-miRNA區(qū)域刪除效率分別為24％和20％，測(cè)序確定其基因型，篩選出純合刪除突變體mir169a和mir827a。Northern blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純

5、合刪除突變體mir169a中miR169的表達(dá)量明顯減弱。干旱脅迫處理實(shí)驗(yàn)表明，純合刪除突變體mir169a表現(xiàn)為更強(qiáng)的耐旱性。
　　3.基因替換技術(shù)體系的設(shè)計(jì)與建立。基于基因刪除技術(shù)體系，選取AtTFL1基因部分片段為替換目標(biāo)區(qū)域，選取靶位點(diǎn)，構(gòu)建基因刪除編輯載體?；贖R修復(fù)原理，設(shè)計(jì)兩段800bp左右與AtTFL1基因替換目標(biāo)區(qū)域外側(cè)序列一致的同源臂，分別連接到核定位表達(dá)盒35S:eGFP:NOS的兩端，在兩端分別設(shè)計(jì)和替換

6、目標(biāo)區(qū)域一致的靶位點(diǎn)，構(gòu)建修復(fù)模板載體。
　　4.基因替換突變體篩選、鑒定與表型分析。通過(guò)特異性引物對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出AtTFL1基因部分片段替換突變體，統(tǒng)計(jì)得到替換效率為0.8％。篩選出AtTFL1基因部分片段發(fā)生替換并且修復(fù)模板發(fā)生刪除的突變體，觀察eGFP表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，eGFP在擬南芥葉和根中能穩(wěn)定表達(dá)。
　　5.基因刪除、基因替換編輯目標(biāo)突變的遺傳。篩選出基因刪除雜合植株和基因替換植株，對(duì)后代進(jìn)行鑒定