RHPN2通過調(diào)控Notch通路在肺腺癌中促進(jìn)腫瘤生成.pdf

1、研究背景:目前，肺癌仍然是全球范圍內(nèi)人類頭號(hào)惡性腫瘤殺手。大量研究者們一直以來致力于研究肺癌的發(fā)生機(jī)制、肺癌的轉(zhuǎn)移特征、肺癌早期診斷以及治療等，并且取得了相當(dāng)大的進(jìn)步。然而，由于空氣污染以及吸煙等原因，世界上肺癌的總體發(fā)病率依然居高不下。我國(guó)是世界上的肺癌大國(guó)，2015年中國(guó)惡性腫瘤流行病學(xué)調(diào)查研究數(shù)據(jù)顯示：肺癌在我國(guó)的發(fā)病率是733.3/10萬人，是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤。其中男性為509.3/10萬人，女性為224/10萬人。而在

2、腫瘤相關(guān)死亡方面，肺癌也處于首位，死亡率為610.2/10萬人，其中男性432.4/10萬，女性為177.8/10萬。該發(fā)病率和死亡率成上升趨勢(shì)，因此對(duì)于肺癌的早期篩查和診治顯得異常重要。目前，對(duì)于肺癌的早期篩查最佳的方法是低劑量螺旋CT掃描，傳統(tǒng)的治療方法是手術(shù)、放療和化療。然而，由于癥狀隱匿，低劑量螺旋CT仍然會(huì)遺漏一些早期腫瘤患者。另外，部分進(jìn)展期不能接受手術(shù)的患者只能接受放化療，而放化療所伴隨的不良反應(yīng)和并發(fā)癥使很多患者放棄治療

3、。隨著人們對(duì)惡性腫瘤認(rèn)識(shí)越來越多，研究者們發(fā)現(xiàn)從細(xì)胞分子水平來研究肺癌的發(fā)生發(fā)展以及其生物學(xué)特性對(duì)肺癌的防治有著相當(dāng)大的幫助，如分子標(biāo)記物能早期預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)展和細(xì)胞靶向治療。因此，對(duì)肺癌進(jìn)行生物學(xué)的基礎(chǔ)科研并尋找潛在的生物靶點(diǎn)是目前重點(diǎn)熱點(diǎn)。
　　在肺癌的基礎(chǔ)研究方面，由于新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使得研究者們可以大規(guī)模對(duì)人類腫瘤基因組進(jìn)行快速準(zhǔn)確的測(cè)序，從而進(jìn)一步了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制以及為腫瘤的診治提供潛在的生物細(xì)胞靶點(diǎn)。在前期的工作

4、中對(duì)肺腺癌的臨床腫瘤樣本以及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)樣本進(jìn)行了測(cè)序，在測(cè)序結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)了 Rho GTP酶結(jié)合蛋白（Rhpn2）在多個(gè)不同的肺癌樣本中存在不同程度的突變和表達(dá)量改變。Rhpn2在正常機(jī)體中能和RhoA結(jié)合，從而激活RhoA相關(guān)的下游細(xì)胞信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)以及細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架的形成有著重要的調(diào)控作用。而在腫瘤細(xì)胞中，由于 Rhpn2的異常表達(dá)可能會(huì)使得腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞骨架異常，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定以及細(xì)胞粘附功能改變，從而使

5、腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌和大腦膠質(zhì)瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，Rhpn2的異常表達(dá)可以引起腫瘤細(xì)胞的表皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）這生物學(xué)行為發(fā)生，因此腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶從而轉(zhuǎn)移至其他組織和器官。既往的研究發(fā)現(xiàn)RhoA分子和一些傳統(tǒng)的細(xì)胞信號(hào)通路有著密切聯(lián)系，目前已發(fā)現(xiàn)與Hippo通路以及Notch通路有不同程度的關(guān)聯(lián)。然而，作為RhoA結(jié)合蛋白的Rhpn2在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色目前尚未有研究。Rhpn2作用的機(jī)制也仍

6、未清楚。
　　第一部分Rhpn2在肺腺癌中的表達(dá)以及臨床意義
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?檢測(cè)肺腺癌患者臨床腫瘤樣本、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)以及與之配對(duì)的癌旁非腫瘤組織中Rhpn2基因mRNA的表達(dá)水平。探討Rhpn2表達(dá)水平與肺癌患者臨床特征以及預(yù)后的關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.收集了在2011年6月至2011年9月之間以及2011年9月至2012年6月之間于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科接受了肺部腫瘤切除術(shù)并且術(shù)后病理提示肺腺癌的

7、患者分別57名及125名。我們提取了患者的新鮮腫瘤標(biāo)本以及相對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織，液氮凍存?zhèn)溆?。其?7名患者作為前期實(shí)驗(yàn)樣本，而125名患者作為驗(yàn)證樣本。除此以外，我們收集并整理了該125名患者的臨床資料以及其預(yù)后信息。
　　2.提取腫瘤和癌旁組織樣本的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再使用 qRT-PCR(熒光定量 PCR)方法檢測(cè)腫瘤及癌旁組織樣本的Rhpn2水平，并且對(duì)患者進(jìn)行預(yù)后的隨訪。
　

8、　3.使用 qRT-PCR方法檢測(cè)各常見肺癌細(xì)胞系（包括：H1975、H460、SPC-A-1、95D、HCC827、H520、PC-9、H358、H1650、H1299和A549）以及正常支氣管上皮細(xì)胞（HBE）的Rhpn2水平。我們選取了Rhpn2表達(dá)最高的兩個(gè)細(xì)胞系H1299及A549作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，使用組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑（丁酸鈉）對(duì)H1299及A549進(jìn)行處理后，再次檢測(cè)未處理及處理過的H1299和A549中Rh

9、pn2的水平。
　　4.所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件19.0進(jìn)行分析。癌與癌旁組織中的Rhpn2 mRNA比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。以中位數(shù)為臨界值分為Rhpn2高表達(dá)組和Rhpn2低表達(dá)組，使用卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)分析Rhpn2 mRNA表達(dá)量與患者臨床生存預(yù)后之間的關(guān)系，并繪制Kaplan-Meier生存曲線，使用Log-rank test比較兩組間生存差異。處理組的H1299及A549與未處理組之間

10、Rhpn2表達(dá)水平比較使用t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.前期的測(cè)序工作提示在腫瘤組織中Rhpn2的表達(dá)明顯高于配對(duì)的癌旁組織中的Rhpn2表達(dá)，并且結(jié)果由統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。發(fā)現(xiàn)在驗(yàn)證組的125名患者中，腫瘤組的Rhpn2表達(dá)高于癌旁組織Rhpn2的表達(dá)，然而結(jié)果無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　2.在驗(yàn)證組中125名患者的腫瘤組織中，以癌旁組織的Rhpn2表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)將患者分為 Rhpn2高表達(dá)組（n=

11、78）和低表達(dá)組（n=47）。Kaplan-Meier曲線以及Log-rank test結(jié)果提示Rhpn2高表達(dá)組患者的總生存期（OS）明顯比低表達(dá)組的患者差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.在對(duì)常見肺癌細(xì)胞系中Rhpn2 mRNA水平檢測(cè)以及HBE檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)肺腺癌細(xì)胞系 H1299以及 A549中的 Rhpn2水平高于其他腫瘤細(xì)胞系以及HBE，其中以A549最明顯。使用HDAC抑制劑處理后的H1299及A549中Rhpn2表達(dá)水平明

12、顯高于未作任何處理的 H1299和 A549，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1. Rhpn2在肺腺癌組織中有不同程度的表達(dá)；Rhpn2在癌組織中的表達(dá)水平比癌旁組織高。
　　2.在肺腺癌患者中，Rhpn2高表達(dá)的患者較低表達(dá)的預(yù)后更差患者差。
　　3. Rhpn2在在大部分肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)均高于在正常支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)；Rhpn2在肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中存在著明顯高表達(dá)的現(xiàn)象。
　　第二部分

13、Rhpn2促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖、侵襲以及誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?分別建立穩(wěn)定的過表達(dá)Rhpn2以及低表達(dá)Rhpn2的肺腺癌細(xì)胞模型，并且檢測(cè)過表達(dá)、低表達(dá)以及正常表達(dá) Rhpn2的肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移等細(xì)胞功能。通過對(duì)不同細(xì)胞模型中的功能差異的比較，探討 Rhpn2在腫瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能。上調(diào)非腫瘤細(xì)胞中的 Rhpn2表達(dá)水平，檢測(cè)過表達(dá) Rhpn2及未處理的非腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞功能變化，探討過表達(dá) Rhpn2

14、對(duì)非腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞功能影響。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.建立表達(dá)目標(biāo)基因的細(xì)胞模型：使用設(shè)計(jì)的引物通過PCR方法擴(kuò)增了野生型Rhpn2基因（Rhpn2-WT）以及Rhpn2兩種不同的突變（V73M和H357L）。使用分子克隆方法制備了含有Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M、Rhpn2-H357L以及含有Rhpn2靶向短發(fā)卡RNA的質(zhì)粒。另外，通過慢病毒感染技術(shù)分別建立了含有空白載體、過表達(dá)Rhpn2-WT、Rhpn2-V7

15、3M、Rhpn2-H357L以及Rhpn2下調(diào)的 H1299和含空白載體及 shRNA-Rhpn2的 A549的肺腺癌細(xì)胞模型。使用qRT-PCR方法驗(yàn)證細(xì)胞模型中Rhpn2及其突變體的mRNA表達(dá)情況，同時(shí)使用了Western blot方法驗(yàn)證細(xì)胞模型中Rhpn2及其突變體的Rhpn2蛋白表達(dá)情況，內(nèi)部參照使用β-Actin。
　　2.檢測(cè)細(xì)胞模型的細(xì)胞功能：分別對(duì)H1299和A549含有不同表達(dá)水平的Rhpn2細(xì)胞模型進(jìn)行細(xì)胞

16、功能實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容包括了細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)等，分別檢測(cè)不同細(xì)胞模型的增殖、生長(zhǎng)、遷移和侵襲等細(xì)胞功能。
　　3.建立含目標(biāo)基因的非腫瘤細(xì)胞裸鼠種植瘤模型：使用慢病毒感染方法將制備好的含有空白載體、過表達(dá) Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M、Rhpn2-H357L以及含Rhpn2靶向短發(fā)卡RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入非腫瘤細(xì)胞，即小鼠纖維母細(xì)胞系（NIH-3T3）中。建立了穩(wěn)定的含有空白載體、過表達(dá)Rhpn2-WT

17、、Rhpn2-V73M、Rhpn2-H357L和Rhpn2下調(diào)的3T3細(xì)胞模型，分別進(jìn)行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)。24只年齡為4-6周的BALB/c雄性裸鼠隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組（空白載體）、Rhpn2組（Rhpn2-WT）、V73M組（Rhpn2-V73M）和H357L組（Rhpn2-H357L）。分別將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的含有空白載體、過表達(dá)Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M以及Rhpn2-H357L的3T3細(xì)胞稀釋至2×107cel

18、ls/mL，取每只裸鼠0.1ml分別種植在裸鼠的右側(cè)腹股溝處。
　　4.裸鼠觀察及種植瘤評(píng)估：完成細(xì)胞種植后每2天觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)力、反應(yīng)、飲食、體重、皮膚顏色及右側(cè)腹股溝處的腫瘤形成情況并且測(cè)量腫瘤大小。于種植細(xì)胞后的3周將裸鼠處死并收集裸鼠右側(cè)腹股溝種植瘤，計(jì)算各細(xì)胞系種植瘤的體積，公式為：體積=（長(zhǎng)徑×短徑2）/2；石蠟包埋各細(xì)胞系種植瘤，制備病理H/E染色玻片，200倍顯微鏡下觀察種植瘤細(xì)胞情況。任意選取10個(gè)高倍鏡

19、視野，計(jì)算各組種植瘤的異型細(xì)胞數(shù)目。
　　5. Western blot結(jié)果采用ImageJ軟件中的灰度檢測(cè)工具量化，再比較各實(shí)驗(yàn)組之間蛋白表達(dá)差異。所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件16.0進(jìn)行分析。各個(gè)含目標(biāo)基因的細(xì)胞系中Rhpn2 mRNA表達(dá)程度用自然對(duì)數(shù)e為底數(shù)計(jì)算其取對(duì)數(shù)值。結(jié)果記錄為相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組之間的相對(duì)表達(dá)量比較使用t檢驗(yàn)。克隆形成、軟瓊脂克隆形成以及Transwell實(shí)驗(yàn)中各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的克隆數(shù)目以及Transwell細(xì)

20、胞數(shù)目比較使用t檢驗(yàn)。裸鼠實(shí)驗(yàn)中，不同實(shí)驗(yàn)組之間的種植瘤體積比較采用t檢驗(yàn)，不同實(shí)驗(yàn)組的種植瘤病理切片中異型細(xì)胞數(shù)目比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.使用分子克隆技術(shù)以及慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了H1299的空白載體、過表達(dá)Rhpn2-WT以及Rhpn2兩個(gè)突變體（V73M和H357L）的細(xì)胞模型。另外，通過轉(zhuǎn)入靶點(diǎn)為 Rhpn2的 shRNA，獲得了低表達(dá) Rhpn2的 H1299和A549

21、細(xì)胞模型。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)shRNA-Rhpn2的H1299及A549細(xì)胞中的Rhpn2表達(dá)明顯低于空白載體的H1299和A549細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot結(jié)果提示含Rhpn2-WT和Rhpn2兩個(gè)突變體（V73M和H357L）的H1299細(xì)胞模型總Rhpn2蛋白表達(dá)明顯高于含空白載體的H1299細(xì)胞。結(jié)果提示細(xì)胞模型建立成功。
　　2.在細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)中，空白載體的 A549細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯多于含s

22、hRNA-Rhpn2的A549細(xì)胞（115.3±7.22個(gè)vs34.67±1.86個(gè),p=0.0004），結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異?？瞻纵d體的H1299細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯多于含shRNA-Rhpn2的H1299細(xì)胞（97.75±2.96個(gè)vs35.5±1.71個(gè), p<0.0001），結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。過表達(dá)Rhpn2、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的H1299細(xì)胞的克隆形成數(shù)目明顯較空白載體的H1299多。在Transwell

23、實(shí)驗(yàn)中，shRNA-Rhpn2的H1299和A549細(xì)胞的細(xì)胞遷移數(shù)目明顯少于空白載體的 H1299細(xì)胞（100.7±1.76個(gè) vs52.33±3.18個(gè),p=0.0002）和A549細(xì)胞(102.7±3.76個(gè)vs52.67±2.08個(gè),p=0.0003)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.在3T3細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)含有 Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的3T3細(xì)胞的克隆形成數(shù)目明顯多于空白載體和含有 Rh

24、pn2-WT的3T3細(xì)胞，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。另外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含Rhpn2突變體的3T3細(xì)胞，其軟瓊脂克隆灶的大小明顯超過空白載體及Rhpn2-WT的3T3細(xì)胞。取24只BALB/c雄性裸鼠隨機(jī)分成4組進(jìn)行細(xì)胞懸液注射。由于在進(jìn)行V73M及H357L組注射時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞懸液漏出，因此從對(duì)照組及Rhpn2野生組中隨機(jī)取兩只裸鼠放入V73M及H357L組。各組裸鼠無意外死亡，種植瘤成瘤率100％。各組裸鼠體重、活動(dòng)度等均無明顯變化，皮膚顏色紅潤(rùn)無蒼

25、白。
　　4.種植成功后3周將裸鼠處死，取出各組裸鼠右側(cè)腹股溝種植瘤分別稱重并計(jì)算種植瘤體積。結(jié)果提示Rhpn2組、V73M組和H357L組的種植瘤都比對(duì)照組的種植瘤重，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中Rhpn2組的種植瘤重量最大。Rhpn2組、V73M組和 H357L組的種植瘤體積均大于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Rhpn2組的種植瘤體積最大。石蠟包埋種植瘤并制成H/E染色病理玻片，在每10個(gè)高倍鏡中，Rhpn2組、V73M組和H357L

26、組的異常有絲分裂細(xì)胞數(shù)均多于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中V73M組的異常細(xì)胞數(shù)目在4個(gè)組中最高。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1. Rhpn2及其兩個(gè)突變體在體外能促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲功能，下調(diào)Rhpn2表達(dá)則能抑制該細(xì)胞功能。
　　2. Rhpn2及其兩個(gè)突變體能在體外增強(qiáng)非腫瘤細(xì)胞3T3在惡劣環(huán)境下的生長(zhǎng)能力。
　　3.高表達(dá)Rhpn2及其兩個(gè)突變體的非腫瘤細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)成瘤能力明顯比普通非腫瘤細(xì)胞強(qiáng)，而

27、且實(shí)驗(yàn)組的異形有絲分裂細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，說明Rhpn2及突變體可能有誘導(dǎo)非腫瘤細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。
　　第三部分 Rhpn2與Hippo通路和Notch通路的關(guān)系研究
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?在上調(diào)及下調(diào) Rhpn2在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平后，檢測(cè) Hippo和 Notch等通路中的關(guān)鍵因子表達(dá)水平。探討Rhpn2與Hippo和Notch等通路的關(guān)系，以及Rhpn2調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1. Rhpn2與Rh

28、oA能結(jié)合，而RhoA與Hippo通路關(guān)系密切，因此在含有空白載體、表達(dá)Rhpn2、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的H1299細(xì)胞中檢測(cè)RhoA活性。在實(shí)驗(yàn)前給與細(xì)胞無血清培養(yǎng)基血清饑餓過夜，在收集細(xì)胞前10分鐘給與細(xì)胞10%血清刺激。使用蛋白裂解液和細(xì)胞刷收集含目的基因的H1299細(xì)胞蛋白，液氮速凍后使用冰盒保存。各組蛋白加入Rho GST在4℃孵育1小時(shí)。將樣本離心并去除上清液，使用試劑盒專用裂解液對(duì)孵育產(chǎn)物進(jìn)行裂解，

29、使用Western blot方法檢測(cè)樣本中的GTP-RhoA和RhoA的蛋白表達(dá)量。
　　2.為了研究Rhpn2與Hippo通路關(guān)鍵因子YAP及磷酸化YAP（p-YAP）關(guān)系，收集了表達(dá)空白載體、Rhpn2及其突變體的 H1299細(xì)胞總蛋白，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白描繪標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線并計(jì)算所收集細(xì)胞的蛋白含量。使用Western blot方法和特異性抗體檢測(cè)了不同細(xì)胞中的YAP和p-YAP表達(dá)情況，內(nèi)部參照使用β-Actin。
　　3.為

30、了發(fā)現(xiàn)Rhpn2與Notch信號(hào)通路的聯(lián)系，我們收集了表達(dá)空白載體以及表達(dá)shRNA-Rhpn2的H1299細(xì)胞的RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄PCR將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用qRT-PCR方法檢測(cè)了兩組細(xì)胞中Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子或靶向基因，包括了DLL1、DLL3、HES1、HES7、Lfng、Notch1和Nrarp等。
　　4.收集了表達(dá)空白載體、Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和 Rhpn2-H357L的 H12

31、99細(xì)胞中的總蛋白，使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白描繪標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線并計(jì)算所收集細(xì)胞的蛋白含量，使用Western blot方法和HES1抗體檢測(cè)各細(xì)胞中HES1蛋白表達(dá)程度。使用γ-分泌酶抑制劑DAPT處理含空白載體的H1299細(xì)胞作為陽性對(duì)照，shRNA-Rhpn2的H1299細(xì)胞則未經(jīng)過DAPT處理，使用qRT-PCR方法檢測(cè)HES1 mRNA表達(dá)量。EDTA能激活Notch通路從而上調(diào)HES1表達(dá)，因此使用Western blot方法檢測(cè)了未處理、

32、PBS處理、EDTA處理后0.5小時(shí)和EDTA處理后1小時(shí)的含空白載體和 shRNA-Rhpn2的 H1299細(xì)胞，內(nèi)部參照使用β-Actin。最后，使用qRT-PCR方法檢測(cè)經(jīng)過血清饑餓過夜以及饑餓后血清刺激6小時(shí)的含目標(biāo)基因的H1299細(xì)胞（空白載體、Rhpn2-WT以及Rhpn2兩種突變體）中的HES1表達(dá)的。
　　5.所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件19.0進(jìn)行分析。Western blot結(jié)果使用ImageJ的灰度檢測(cè)功能量化。

33、量化后實(shí)驗(yàn)組之間的比較使用t檢驗(yàn)，qRT-PCR的檢測(cè)結(jié)果以自然對(duì)數(shù)e為底數(shù)計(jì)算其對(duì)數(shù)值。結(jié)果記錄為相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組之間的相對(duì)表達(dá)量比較使用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.在RhoA活性實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)血清刺激能明顯增加H1299細(xì)胞中的活化RhoA的蛋白表達(dá)量，然而在表達(dá)Rhpn2-WT的H1299細(xì)胞中，沒發(fā)現(xiàn)血清刺激能增加活化 RhoA的蛋白表達(dá)量。同樣在無血清刺激的情況下， Rhpn2-W

34、T比對(duì)照組能增加活化 RhoA的蛋白量。在 Rhpn2-V73M組和Rhpn2-H357L組H1299細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)血清刺激后活化的RhoA蛋白表達(dá)量比無血清刺激時(shí)更低。
　　2.在檢測(cè)含各目標(biāo)基因的H1299細(xì)胞中YAP和p-YAP的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組的YAP蛋白表達(dá)量之間無差異，而Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L組的p-YAP蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組的p-YAP表達(dá)量，其中以Rhpn2-V

35、73M最明顯，說明Rhpn2高表達(dá)可以增加p-YAP的表達(dá)量。
　　3.在對(duì)多個(gè)潛在靶向基因的表達(dá)水平檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)在 shRNA-Rhpn2的H1299細(xì)胞中，HES1的表達(dá)量明顯低于表達(dá)空白載體的H1299細(xì)胞。同時(shí)在A549細(xì)胞中，表達(dá) shRNA-Rhpn2的細(xì)胞 HES1的表達(dá)量明顯低于空白載體的A549細(xì)胞。
　　4.在 EDTA刺激實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和 PBS中含空白載體和shRNA-Rhpn2的H1299中，H

36、ES1蛋白表達(dá)無明顯變化。在經(jīng)過EDTA刺激0.5小時(shí)后，含 shRNA-Rhpn2的 H1299中的 HES1蛋白表達(dá)明顯低于空白載體的H1299細(xì)胞。在經(jīng)過EDTA刺激1小時(shí)后，含shRNA-Rhpn2的H1299中HES1蛋白表達(dá)仍然低于空白載體的H1299。然而，與EDTA刺激0.5小時(shí)相比，HES1蛋白的表達(dá)程度明顯降低。還發(fā)現(xiàn)含 Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的H1299細(xì)胞中HES1蛋白表達(dá)

37、高于空白對(duì)照組的HES1蛋白表達(dá)。
　　5.經(jīng)過血清刺激6小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組中， HES1的mRNA表達(dá)水平均比未接受血清刺激時(shí)高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而無論是否接受血清刺激，Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L組的HES1表達(dá)水平均高于對(duì)照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。其中 Rhpn2-WT在接受血清刺激6小時(shí)后HES1表達(dá)水平最高。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1.在無血清刺激下， Rhpn2-

38、WT能增加活化 RhoA的表達(dá)水平， Rhpn2-V73M則能抑制RhoA活化。在血清刺激下，Rhpn2-WT未能上調(diào)活化RhoA的表達(dá)水平。然而，Rhpn2突變體能明顯抑制RhoA活化。
　　2. Rhpn2-WT以及其突變體能明顯上調(diào)p-YAP蛋白表達(dá)。作為YAP的活化形式，p-YAP可以抑制Hippo通路。即Rhpn2可以通過活化YAP間接抑制Hippo通路。
　　3.在H1299及A549細(xì)胞中，抑制Rhpn2表達(dá)可

39、明顯抑制HES1的表達(dá)。在mRNA水平，過表達(dá)Rhpn2-WT以及Rhpn2突變體可以明顯上調(diào)HES1的表達(dá)水平，該現(xiàn)象在接受血清刺激6小時(shí)后更加明顯。而在蛋白水平，過表達(dá)Rhpn2-WT以及Rhpn2突變體可以小幅度上調(diào)HES1的表達(dá)。
　　4.抑制Rhpn2表達(dá)可以明顯抑制HES1的表達(dá)。在Notch通路激動(dòng)劑EDTA刺激后0.5小時(shí)，HES1蛋白表達(dá)明顯升高。1小時(shí)后，HES1蛋白表達(dá)程度較0.5小時(shí)下降。然而，抑制Rhpn

40、2表達(dá)仍然可以在EDTA刺激下明顯下調(diào)HES1的蛋白表達(dá)。說明Rhpn2可通過與HES1作用而調(diào)控Notch通路。
　　全文總結(jié):
　　1.高表達(dá)Rhpn2的肺腺癌患者其預(yù)后不佳。Rhpn2可以增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，同時(shí)Rhpn2可以使非腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)惡性生物學(xué)行為。
　　2.在無血清刺激情況下，Rhpn2可以增加RhoA的活性，從而間接抑制Hippo通路的激活。然而Rhpn2卻可以增加p-YAP