香莢蘭乙酮對三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石形成的影響及其機制研究.pdf

1、背景：2007年，美國4000多只狗、貓食用了含有三聚氰胺的飼料而出現(xiàn)腎功能衰竭。2008年，因長期食用含有三聚氰胺的嬰幼兒配方奶粉，我國累計294,000嬰幼兒接受檢查治療，其中住院患兒51,900人，死亡4人，主要是因為三聚氰胺導致了泌尿系結(jié)石和腎衰竭。2008年，就診于我院門診的泌尿系結(jié)石患兒數(shù)量也明顯增多，這些患兒年齡多在3歲以內(nèi)，表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、哭鬧、惡心、腹瀉、嘔吐、少尿、無尿、血尿等癥狀，少數(shù)家屬發(fā)現(xiàn)患兒尿液混濁或

2、在患兒尿液中發(fā)現(xiàn)泥沙樣結(jié)石排出，通過超聲可以診斷為泌尿系結(jié)石。當詢問這些患兒病史時，我們發(fā)現(xiàn)這些患兒都在喂養(yǎng)同一品牌奶粉（三鹿牌嬰幼兒配方奶粉）。隨后，我院泌尿外科將該事件及時上報省衛(wèi)生廳。并針對這一社會重大熱點問題，采用流行病學方法探討了嬰幼兒發(fā)生三聚氰胺泌尿系結(jié)石以及梗阻性急性腎損傷的危險因素。在臨床診治過程中探索了體外沖擊波碎石、手術(shù)干預等治療方案，改進了藥物溶石及腎后性急性腎損傷的治療方案，建立了一整套行之有效的診療方法。對部分

3、患兒進行了1到3年的跟蹤隨訪，并對不同治療方式的安全性、有效性進行了評價。采用相關(guān)物理化學方法，定量測定了患兒結(jié)石、血漿及尿液標本中三聚氰胺含量并定性分析了結(jié)石的形態(tài)及成分。然而關(guān)于三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石細胞和動物模型的建立及實驗研究在國內(nèi)外均較少，氧化損傷被認為是普通泌尿系結(jié)石形成的重要機制之一，本研究首先建立三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石細胞和動物模型，之后我們利用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）氧化酶的抑制劑香莢蘭乙酮（apocy

4、nin）對這兩種模型進行干預，為抗氧化損傷預防和治療三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石提供分子生物學依據(jù)。
　　目的：通過建立三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石細胞和動物模型，觀察氧化損傷程度、泌尿系結(jié)石相關(guān)蛋白的表達、動物腎臟組織病理變化、腎臟內(nèi)結(jié)晶的沉積和腎毒性的改變，并預防性和治療性的使用 apocynin，觀察上述指標的變化。從而探討三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石發(fā)病機制，為泌尿系結(jié)石的發(fā)病機制提供相應的理論依據(jù)。
　　方法：在細胞實驗中，通過三聚

5、氰胺和三聚氰酸（melamine and cyanuric acid，MCA）的混合物(600μmol/L，1:1)刺激人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞（HK-2）來建立三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石的細胞模型。同時預防性或治療性地給予不同濃度的香莢蘭乙酮（apocynin）(0.1或0.2 mmol/L)，當MCA混合物作用HK-2細胞24小時后，收集細胞和培養(yǎng)液，檢測氧化應激（OS）的指標丙二醛(MDA)、8-異前列腺素（8-IP）及超氧化物歧化酶

6、(SOD)。同時用免疫印跡（Western blotting）的方法半定量檢測泌尿系結(jié)石相關(guān)蛋白骨橋蛋白（OPN）和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表達情況。在動物實驗中，通過給予MCA混合物(400 mg/day/kg，1:1)誘導雄性SD大鼠三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石的形成。同時預防性或治療性地給予不同濃度的香莢蘭乙酮（0.2或0.4 g/kg/day），造模28天后，對大鼠和其腎臟進行稱重，并收集大鼠的尿液、血液和腎臟，檢測OS和腎毒

7、性（絕對腎重量、相對腎重量、尿素氮和血肌酐）的指標，對大鼠一側(cè)腎臟用20％的甲醛進行固定并進行HE染色石蠟切片，普通光學顯微鏡下觀察大鼠腎臟的病理變化及結(jié)晶的形成情況并進行評分。并用激光共聚焦顯微鏡對沒有 HE染色透明的石蠟切片內(nèi)的結(jié)晶進行觀察。同時用免疫組織化學的方法對腎組織切片進行免疫組化染色，觀察泌尿系結(jié)石相關(guān)蛋白OPN和p-p38 MAPK的表達情況，用Western blotting的方法對這兩種蛋白進行半定量。
　　結(jié)

8、果：在細胞實驗中，被MCA混合物誘導的HK-2細胞中，OS指標、OPN和p-p38 MAPK兩種泌尿系結(jié)石相關(guān)蛋白表達都是增高的，當預防性的給予apocynin后，上述指標下降（p<0.05）.但是當治療性的給予apocynin后，OS指標下降（p<0.05），但結(jié)石相關(guān)蛋白OPN和p-p38沒有顯著的變化（p>0.05）。在動物實驗中，MCA混合物誘導的三聚氰胺相關(guān)泌尿系結(jié)石 SD大鼠腎毒性、腎臟病理變化評分、腎結(jié)晶評分、OS指標以及