陰溝腸桿菌中若干β-內酰胺類耐藥基因的篩選及功能研究.pdf

1、目的：
　　通過高通量測序以及生物信息學的方法鑒定陰溝腸桿菌基因組數(shù)據中β-內酰胺類耐藥基因的分布情況。篩選出所選耐藥基因并研究其耐藥性，接合轉移實驗探討基因定位，推測其傳播機制。
　　方法：
　　1、本課題以2009年到2011年從溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院臨床分離得到的238株革蘭氏陰性桿菌菌陰溝腸桿菌作為本實驗的測序菌株。每株細菌經過單獨培養(yǎng)，混合后采用SDS法提取混合細菌基因組DNA，送到中科院北京基因組研究所進

2、行solexa測序。
　　2、通過利用生物信息學工具，將測序數(shù)據與從NCBI的GenBank數(shù)據庫中收集的β-內酰胺類耐藥基因序列進行比對分析，找出測序數(shù)據中包含的β-內酰胺類耐藥基因的類型以及豐度的差異。為進一步實驗做出預測及理論上的依據。
　　3、選取鑒定到的β-內酰胺類耐藥基因中報道較少的blaVEB，blaZ，blaMIR，blaKLUC，blaAZECL-29為代表，設計特異性引物，以2008年到2012年從溫州醫(yī)

3、科大學附屬第一醫(yī)院臨床得到的212株陰溝腸桿菌基因組DNA為模板，PCR反應篩選出含有目的基因的菌株，并對目的基因進行測序，確定其基因型。
　　4、將全部目的基因分別連接至表達載體pET-28a上，再轉化到工程菌大腸桿菌BL21中，然后通過瓊脂稀釋法來測定陽性克隆株對多種β-內酰胺類抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，通過與陰性對照菌的MIC值比較來判斷其耐藥功能。
　　5、通過接合轉移實驗來探究耐藥基因是否編碼于可接合轉移質

4、粒，并推測其傳播機制。
　　結果：
　　1、陰溝腸桿菌基因組經測序產生294，298，898對solexa reads，利用生物信息學技術我們在陰溝腸桿菌的基因組數(shù)據當中共鑒定到14種β-內酰胺類耐藥基因，它們分別是blaVEB，blaZ，blaDHA，blaSHV，blaiR，blaTEM，blaOXA，blaCTX-M-9，blaSFO,ampH,blaCTX-M-1,blaKLUC,blaACT,blaAZECL-29

5、。
　　2、選取相對稀有β-內酰胺類耐藥基因blaVEB，blaZ，blaMIR，blaKLUC，blaAZECL-29設計特異性引物，以陰溝桿菌基因組DNA為模板，PCR擴增反應篩選出1株陰溝腸桿菌基因組攜帶blaVEB基因，2株攜帶blaZ基因，6株攜帶blaMIR基因，2株攜帶blaAZECL-29基因，其中blaVEB基因與數(shù)據庫中的blaVEB-3基因亞型相似性為100％，blaMIR及blaAZECL-29與數(shù)據庫中最

6、為接近的基因型都具有99％以上的相似性。
　　3、耐藥基因blaVEB(Y412)對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢噻利、頭孢唑林等藥物表現(xiàn)出了顯著耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了7、8、7、4、3個梯度，耐藥基因blaZ(CG3)、blaZ(CG4)只表現(xiàn)出對氨芐西林的耐藥性的提升，耐藥濃度提升了3個梯度。不同亞型的blaMIR基因耐藥功能基本一致，同時表現(xiàn)出了對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢米諾、頭孢唑林、頭孢

7、西丁、頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、派拉西林他唑巴坦的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了8、6、8、6、5、7、4、9、6、4、4個梯度。兩種亞型的耐藥基因blaAZECL-29(Y411)、blaAZECL-29(CG90)的耐藥性基本相同，同時表現(xiàn)出了氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢米諾、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢曲松、哌拉西林、派拉西林他唑巴坦的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提高了6、5、4、4、7、3、8、4、3個梯度。
　　4、

8、接合轉移實驗得1株成功接合子Y412/EC600，提取供體菌及接合子質粒質粒，電泳結果表明供體菌Y412中大小約為20-50kb的質粒經細菌接合轉移進入了受體菌EC600。結合PCR擴增實驗表明blaVEB未位于接合子質粒中，其余陽性細菌皆為接合轉移實驗陰性，藥物敏感實驗中接合子表現(xiàn)出了對氨芐西林、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢噻利、頭孢唑林、頭孢曲松、氨曲南、哌拉西林、哌拉西林他唑巴坦、亞胺培南西司他丁等多種β內酰胺類抗生素顯著的

9、耐藥性的提升，耐藥濃度分別提高了10、6、7、8、8、8、11、12、6、6、4個梯度。
　　結論：
　　1、方法學上表明，高通量測序技術與生物信息學方法的結合，可以使我們在短時間內獲得上百株細菌的基因組序列，探索基因組序列結構與病原微生物的耐藥性關系，對于致病菌中耐藥基因的分布和新基因的發(fā)掘及功能研究起著及其有效的作用;生物信息學的預測分析對實驗操作具有強烈的指導作用，然而信息學的結論同時也需要對應的實驗結果來驗證。

10、>　　2、從溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院分離的陰溝腸桿菌中預測并成功篩選得到1株攜帶blaVEB基因、2株攜帶blaZ基因、6株攜帶blaMIR基因、2株攜帶blaAZECL-29基因。
　　3、耐藥基因blaVEB對半合成廣譜青霉素氨芐西林、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢他啶、頭孢哌酮、四代頭孢頭孢噻利等藥物表現(xiàn)出了顯著耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了7、3、8、7、4個梯度，由此可見β內酰胺類耐藥基因blaVEB具有多種β內酰胺類

11、抗生素的耐藥性。其中對半合成廣譜青霉素氨芐西林、三代頭孢頭孢他啶、頭孢哌酮耐藥性的提高尤為明顯，耐藥梯度分別提高了7、8、7個梯度。耐藥基因blaZ只表現(xiàn)出對半合成廣譜青霉素氨芐西林的耐藥性的提升，耐藥濃度提升了3個梯度。不同亞型的blaiR基因耐藥功能基本一致，同時表現(xiàn)出了對半合成廣譜青霉素氨芐西林、哌拉西林、半合成的廣譜青霉素/β內酰胺酶抑制劑派拉西林他唑巴坦、頭霉素類頭孢米諾、頭孢西丁、單環(huán)類氨曲南、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢

12、他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提升了8、4、4、5、4、6、7、6、8、6、9個梯度。由此可見β內酰胺類耐藥基因blaiR具有廣泛的β內酰胺類抗生素的耐藥性。其中對半合成廣譜青霉素氨芐西林及頭孢類抗生素一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性提升尤為明顯，耐藥濃度分別提升了8、7、6、8、6、9個梯度。兩種亞型的耐藥基因blaAZECL-29的耐藥性基本相同，同時表現(xiàn)出了半

13、合成廣譜青霉素氨芐西林、哌拉西林、半合成的廣譜青霉素/β內酰胺酶抑制劑派拉西林他唑巴坦、頭霉素類頭孢米諾、頭孢西丁、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松的耐藥性的提升，耐藥濃度分別提高了6、4、3、4、3、7、5、4、8個梯度。由此可見β內酰胺類耐藥基因blaAZECL-29具有廣泛的β內酰胺類抗生素的耐藥性。其中對三代頭孢頭孢曲松的耐藥性提升尤為明顯，耐藥濃度提高了8個梯度。
　　將不同基因耐藥濃度的提升情況進

14、行對比可以發(fā)現(xiàn)，其中blaMIR基因與blaAZECL-29基因耐藥濃度提升情況非常相似，除了blaMIR基因單獨表現(xiàn)出的頭孢他定和氨曲南耐藥濃度的提升之外，兩基因均表現(xiàn)出了對半合成廣譜青霉素氨芐西林、哌拉西林、半合成的廣譜青霉素/β內酰胺酶抑制劑派拉西林他唑巴坦、頭霉素類頭孢米諾、頭孢西丁、一代頭孢頭孢唑林、三代頭孢頭孢噻肟、頭孢哌酮、頭孢曲松耐藥濃度的提升，耐藥濃度提升的梯度也較為相似，且blaiR基因耐藥濃度提升的梯度均略大于或等

15、于blaAZECL-29基因耐藥濃度提升的梯度。
　　blaMIR及blaAZECL-29基因編碼的氨基酸序列長度相等，且具有95％(361/381)的相似性，對比耐藥濃度提升梯度分析結果可知，兩條氨基酸序列中不同的位點，都可能是blaMIR基因表現(xiàn)出頭孢他啶和氨曲南耐藥性的關鍵位點。而這些位點的改變也使得blaMIR基因對其他β內酰胺類抗生素耐藥的實現(xiàn)產生了一定的影響。
　　4、接合轉移實驗得1株成功接合子Y412/EC6