HBV感染者宿主細胞α-甘露糖苷酶Ⅰ的表達上調(diào)及其影響的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　據(jù)報道全球約20億人有既往或現(xiàn)癥乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的血清學(xué)證據(jù)，其中2.4億人為慢性 HBV感染者。慢性HBV感染往往會進展為終末期肝病、肝硬化以及原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，年死亡人數(shù)可達65萬人。HBV感染持續(xù)存在的原因是多方面的，包括抗原加工和提呈受到抑制、免疫抑制微環(huán)境（IL-10, TGF-β）、CD4 T細胞反應(yīng)

2、低下、細胞因子分泌抑制、負性調(diào)控（PD-1/CTLA-4/Tim-3）、T細胞和B細胞抗原表位逃逸突變、免疫細胞缺失或耗竭（由于高病毒載體或負性調(diào)節(jié)）等。其中，樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)提呈HBV抗原功能缺陷和共刺激分子表達低下，是造成HBV感染持續(xù)存在的一個重要原因。
　　作為一種Ⅱ型跨膜蛋白，DC-SIGN（DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin）是含有外源性

3、甘露糖結(jié)合位點的C型凝集素（C-type lectin，CLR）結(jié)構(gòu)域。其主要表達于淋巴組織成熟DCs與外周組織未成熟DCs表面，在DCs識別病原體相關(guān)分子模式、激活初始T細胞及啟動免疫應(yīng)答，以及病原體的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。有研究顯示DC-SIGN可以識別多種含有高甘露糖寡糖的病毒（例如丙型肝炎病毒,人類免疫缺陷病毒和埃博拉病毒）。HBV是一種DNA病毒，它的包膜蛋白包括大表面抗原、中表面抗原和小表面抗原，均含有豐富的甘露糖寡糖，因

4、此 DC-SIGN很可能參與對HBV的識別。N-糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要修飾，α-甘露糖苷酶 I特異性地作用于甘露糖α-1,2糖苷鍵，可以剪切N-寡糖中的甘露糖殘基，使糖蛋白發(fā)生去甘露聚糖修飾，由高甘露糖型變?yōu)殡s合型或復(fù)雜型。而M. L. Op den Brouw等人的研究揭示了HBV在一定情況下可以被DC-SIGN識別：盡管天然HBV不能與DC-SIGN結(jié)合，但用α-甘露糖苷酶 I抑制劑基夫堿處理產(chǎn)HBV顆粒和乙肝表面抗原的He

5、pG2.2.15細胞，由此產(chǎn)生的高甘露糖HBV和乙肝表面抗原則可被DC-SIGN識別。我們之前體外研究的結(jié)果顯示，與Hep G2細胞相比, Hep G2.2.15細胞MAN1A1、MAN1A2的表達明顯上調(diào)。
　　盡管HBV DNA在外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）中的存在形式、傳染性和致病性存在爭議，但PBMC無疑是HBV肝外感染的重要靶器官。本研究首先通過收集處

6、于不同臨床病程的HBV感染者的外周血，比較和分析不同臨床病程α-甘露糖苷酶I的表達水平，及其與臨床病程、細胞免疫應(yīng)答之間的關(guān)系。另外通過構(gòu)建α-甘露糖苷酶I亞型MAN1A1的過表達和干擾重組腺病毒載體，觀察MAN1A1的表達水平與乙肝表面抗原甘露糖修飾之間的關(guān)系，初步探討α-甘露糖苷酶I表達水平對HBV感染的影響。
　　研究目的：
　　在前期研究工作基礎(chǔ)上，比較和分析α-甘露糖苷酶Ⅰ在不同臨床病程HBV感染中的表達水平，并初

7、步探討α-甘露糖苷酶Ⅰ表達水平對HBV感染的影響。
　　實驗方法：
　　1.收集90名HBV感染者和30名健康對照者的外周血，其中HBV感染者根據(jù)臨床病程分為免疫耐受組、慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）組、非活動性HBsAg攜帶組；
　　2.Western Blot法檢測α-甘露糖苷酶Ⅰ三個亞型MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1蛋白的表達水平，ELISA法檢測血清白介素-12（in

8、terleukin12, IL-12）和γ-干擾素（IFN-γ）水平以及乙肝血清學(xué)標志物，RT-PCR方法檢測HBV DNA；
　　3.使用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，比較和分析α-甘露糖苷酶I在不同階段HBV感染中的表達水平，及其與IL-12、IFN-γ、HBV DNA的關(guān)系；
　　4.根據(jù)Genebank中查詢獲得的人MAN1A1基因設(shè)計并合成特異的shRNA序列，然后通過分子克隆的方法構(gòu)建 MAN1A1的干擾穿

9、梭載體pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA，酶切和測序鑒定；
　　5.根據(jù)Genebank查詢獲取MAN1A1基因的編碼序列，人工合成含有目的基因片段的質(zhì)粒pUC57-MAN1A1，將其與pYr-adshuttle-4穿梭質(zhì)粒連接，構(gòu)建MAN1A1基因的過表達穿梭載體pYr-MAN1A1，酶切和測序鑒定；
　　6.將上述干擾載體pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA和過表達載體pYr-MAN1A1通

10、過 LR體外同源重組分別與pAd/PL-DEST腺病毒骨架質(zhì)粒構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1，酶切和測序鑒定正確后轉(zhuǎn)染至HEK293細胞進行病毒的包裝和擴增，獲得MAN1A1干擾和過表達重組腺病毒。
　　7.分別將MAN1A1干擾和過表達重組腺病毒感染HepG2.2.15細胞細胞，同時設(shè)置對應(yīng)的對照組和基夫堿處理組。感染48h后用Western Blot和RT-PCR法檢測各處理組MAN1

11、A1基因和蛋白的表達水平，并收集不同處理組的上清，植物凝集素ELISA檢測乙肝表面抗原的甘露糖修飾程度。
　　實驗結(jié)果：
　　1.收集到了三個組（免疫耐受組、慢性乙型肝炎組、非活動性HBsAg攜帶組）共90名HBV感染者和30名健康對照者的外周血，并完成各項指標的檢測；
　　2.和健康對照組相比，三個HBV感染者組MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表達均出現(xiàn)明顯的上調(diào)，其中免疫耐受組的患者上調(diào)幅度最大（分別為0

12、.66±0.19、0.66±0.18和0.56±0.15，p＜0.05），CHB組次之。三個HBV感染者組IL-12和IFN-γ水平顯著高于健康對照組（p＜0.05），其中以CHB組最高（IL-12：59.08±13.38 pg/ml，IFN-γ：43.66±12.50 pg/ml，p＜0.05），其次為免疫耐受組；
　　3.對于處于免疫耐受期的患者，MAN1A1、MAN1A2均與 HBeAg滴度和 HBV DNA水平呈線性正相關(guān)

13、，而MAN1C1僅與HBeAg滴度相關(guān)。CHB組的相關(guān)性分析顯示，MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表達與ALT無相關(guān)性（p＞0.05），而與HBeAg和HBV DNA均呈正相關(guān)（r＞0.05，p＜0.01）；
　　4.構(gòu)建了針對MAN1A1的干擾穿梭載體pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA和過表達穿梭載體pYr-MAN1A1，酶切和測序結(jié)果顯示構(gòu)建成功；
　　5.重組腺病毒載體pAd-MAN1A1-s

14、hRNA和pAd-MAN1A1構(gòu)建成功，酶切和測序鑒定正確，并通過HEK293細胞包裝和擴增成功獲得了足夠的重組腺病毒；
　　6.重組腺病毒pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1感染HepG2.2.15細胞后，MAN1A1基因的表達水平分別出現(xiàn)下降和上調(diào)，同時植物凝集素ELISA檢測發(fā)現(xiàn)HepG2.2.15上清中HBsAg分別出現(xiàn)高甘露糖和去甘露糖修飾。
　　結(jié)論：
　　1.不同臨床階段慢性HBV感染者

15、的PBMC普遍存在α-甘露糖苷酶Ⅰ的表達上調(diào)，這種上調(diào)在免疫耐受期的患者最高。而且，免疫耐受組和CHB組α-甘露糖苷酶I的表達水平與HBeAg滴度和HBV DNA水平均呈正相關(guān)。這些結(jié)果說明PBMC中α-甘露糖苷酶I的表達上調(diào)可能在HBV的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用,而且表達水平與病毒復(fù)制的活躍程度密切相關(guān)；
　　2.干擾和過表達α-甘露糖苷酶Ⅰ亞型 MAN1A1的表達，可導(dǎo)致宿主細胞分泌HBsAg的甘露聚糖修飾發(fā)生變化，這進一步證實