荔枝核總黃酮對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)α-SMA、NF-κB表達影響的研究.pdf

1、目的：研究荔枝核總黃酮（TotalFlavonoids ofLitchiChinensisSonn， TFL）對轉(zhuǎn)化生長因子-β1（Transforming Growth Factor beta-1，TGF-β1）誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞T6（Hepatic Stellate Cell-T6，HSC-T6）細(xì)胞增殖及對細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（Nuclear Factor-kappa B，NF-κB）及α-平滑肌肌動蛋白（α-Smooth M

2、uscle Actin，α-SMA）表達的影響。
　　方法：用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞T6，當(dāng)細(xì)胞處于生長對數(shù)期，0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞后，除正常組用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液外，其余組均用含10%FBS的DMEM+5μg/L TGF-β1培養(yǎng)液吹打均勻，配成單細(xì)胞懸液，行細(xì)胞計數(shù)。（1）MTT法檢測細(xì)胞增殖活力。將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12h后，按以下分組處理細(xì)胞，即TGF-β1組（含

3、5μg/L TGF-β1，下同），對照組（含5‰DMSO，下同），TFL80、160、320、640、800組（即80、160、320、640、800 mg/L TFL），每組設(shè)5個復(fù)孔。分別于加藥24、48、72 h后，按MTT法實驗步驟準(zhǔn)備細(xì)胞，采用酶標(biāo)儀分別測定490 nm處各孔吸光度（A）值并分別計算細(xì)胞抑制率及半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50），以確定后續(xù)實驗的藥物濃度組及藥物作用時間。（2） Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)

4、胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。（3）采用半定量PCR法檢測HSC-T6細(xì)胞中α-SMA、NF-κBmRNA的表達。將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12h后，根據(jù)MTT法實驗結(jié)果，重新分組處理細(xì)胞，即TGF-β1組，對照組，TFL125、250、500組（即125、250、500 mg/L TFL組）。分組培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞總RNA。用半定量PCR法檢測各組細(xì)胞中NF-κB、α-SMA mRNA的表達。（4）Weste

5、rn blot檢測HSC-T6細(xì)胞中NF-κB及α-SMA蛋白的表達。將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)12h后，按步驟（2）分組處理細(xì)胞。分組培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，分別提取各組細(xì)胞總蛋白。用Western blot法檢測各組細(xì)胞中NF-κB、α-SMA蛋白的表達。
　　結(jié)果：（1）MTT檢測結(jié)果顯示，在同一作用時間點，隨著TFL濃度的增高，HSC-T6細(xì)胞的A值逐漸降低，相反細(xì)胞抑制率則逐漸上升。（2）熒光顯微鏡下觀察

6、顯示：對照組細(xì)胞胞核完整， TFL250組細(xì)胞見凋亡細(xì)胞核及核碎片。（3）半定量PCR法檢測結(jié)果顯示， TGF-β1組HSC-T6細(xì)胞NF-κB mRNA（0.55±0.04）、α-SMA mRNA（0.36±0.05）表達量與對照組HSC-T6細(xì)胞NF-κB mRNA（0.58±0.06）、α-SMA mRNA（0.41±0.03）表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；TFL125組HSC-T6細(xì)胞NF-κB mRNA（0.53±0

7、.03）、α-SMA mRNA（0.35±0.06）表達量與TGF-β1組、對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；TFL250組HSC-T6細(xì)胞NF-κB mRNA（0.23±0.01）、α-SMA mRNA（0.22±0.02）表達量及TFL500組HSC-T6細(xì)胞NF-κB mRNA（0.14±0.01）、α-SMA mRNA（0.18±0.02）表達量均分別與對照組的NF-κB mRNA、α-SMA mRNA有統(tǒng)計學(xué)差異（P<

8、0.05）。（4）Western blot法檢測各組細(xì)胞中蛋白分析顯示， TFL250組HSC-T6細(xì)胞NF-κB蛋白（0.28±0.07）、α-SMA蛋白（0.38±0.01）表達量及TFL500組HSC-T6細(xì)胞NF-κB蛋白（0.19±0.01）、α-SMA蛋白（0.33±0.13）表達量均分別與對照組的NF-κB蛋白（0.46±0.06）、α-SMA蛋白（0.64±0.13）有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：TFL