拘束應激增加小鼠流感病毒易感性機制研究及小分子活性肽Carnosine的干預作用.pdf

1、除了病毒本身的因素外，宿主自身的易感性在流感疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現病原體感染機體時，機體主要通過直接抗病毒作用與增強機體對病原體的耐受能力發(fā)揮自我保護作用。當機體無法有效發(fā)揮這兩種作用，會引起嚴重感染導致死亡，被稱為流感的“易感個體”。研究表明新生兒、老年人、患有基礎代謝疾病及疲倦或應激負荷下的人群屬于感染流感病毒的“易感人群”，且這部分人群感染流感后死亡率顯著升高，但關于這些因素是如何增加機體“易感性”的機理尚不

2、明確。因此，深入研究流感“易感性”形成機制及如何降低機體“易感性”在防治流感病毒感染中具有重要意義。應激負荷能激活下丘腦-垂體-腎上腺（Hypothalamic pituitaryadrenal。HPA）軸增加糖皮質激素皮質酮（Cortisostone。CORT）的分泌，同時CORT能夠調控先天性免疫反應保護機體抵御病原體感染。前期研究發(fā)現拘束應激負荷能增加小鼠對流感病毒的易感性。因此，本課題以拘束應激負荷與CORT負荷建立小鼠與細胞“

3、易感性”模型，探索CORT在拘束應激負荷增強機體流感“易感性”的作用及機制。
　　首先，本論文研究了拘束應激負荷誘導的應激激素CORT對小鼠流感病毒“易感性”的影響。將小鼠放置于50mL通風良好的離心管中拘束負荷18 h，小鼠于給藥前1 d開始拘束負荷，拘束應激負荷18 h后第3 d以2×LD50的H1N1病毒經滴鼻感染小鼠，實驗組小鼠于拘束負荷后開始每天皮下注射1 mg/kgCORT或25 mg/kg米非司酮（Mifeprist

4、one,RU486），連續(xù)給藥3 d，正常對照組、病毒組和拘束病毒模型組小鼠給予等量溶劑聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）。感染流感病毒后連續(xù)觀察21d或者4d，檢測小鼠感染流感病毒后的發(fā)病率、死亡率與肺組織中的病毒量（Nuclear protein。NP）變化。實驗結果表明，拘束應激負荷小鼠與CORT負荷小鼠感染流感病毒后發(fā)病率、死亡率明顯升高，肺組織中的病毒復制水平（NP蛋白表達）明顯增加，且肺部病理損傷顯著

5、加劇，而皮質酮受體抑制劑RU486能夠改善上述過程。以上實驗結果提示，應激激素CORT增強了小鼠對流感病毒“易感性”。
　　其次，研究應激激素CORT對線粒體抗病毒信號蛋白（Mitochondrial antiviral signaling protein。MAVS）通路的影響。病毒感染機體時，體內的MAVS被激活形成多聚體。MAVS聚集體激活 IRF3與 NF-κB誘導產生大量 I型干擾素（Interferon-I。IFN-I）

6、與抗病毒蛋白（antiviral protein。AVP）從而抑制病毒的感染。本實驗探討了拘束應激負荷增加小鼠流感病毒“易感性”是否與應激誘導的CORT調控MAVS抗病毒信號通路活性有關。將昆明種（KM）小鼠隨機分為以下4組：正常對照組（Control），病毒組（Virus），拘束病毒模型組（Stress+Virus）。RU486組（Stress+Virus+RU486）。小鼠于給藥前1 d開始拘束負荷，拘束負荷18 h后第3 d以2×

7、LD50的H1N1病毒感染機體，實驗組小鼠于拘束負荷后開始每天皮下注射25 mg/kgRU486，連續(xù)給藥3 d，正常對照組、病毒組和拘束病毒模型組給予等量溶劑PEG。將小鼠于感染病毒后的第4 d處死取肺組織，檢測肺組織中MAVS及MAVS聚集體蛋白表達水平。實驗結果顯示，病毒感染增強了小鼠肺組織中MAVS及MAVS聚集體蛋白表達；與病毒組相比，拘束病毒模型組小鼠肺組織中的MAVS及MAVS聚集體蛋白表達顯著下降，RU486上調了兩者蛋

8、白表達。以上結果說明應激激素CORT能夠通過抑制MAVS蛋白及活性，降低機體抗病毒信號。MAVS活化能夠促進IRF3磷酸化與NF-κB活化，從而調控IFN-β應答。為了進一步考察應激誘導的CORT降低IFN-β應答提高小鼠流感“易感性”是否受NF-κB調控，本研究采用NF-κB抑制劑BAY11-7082探討NF-κB信號通路在CORT負荷A549細胞感染流感后對IFN-β的影響。實驗結果表明，與單獨CORT負荷細胞相比，CORT負荷的A

9、549細胞感染流感病毒后NF-κB蛋白表達增強，誘導炎癥因子（TNF-α與 IL-6）釋放增加；與 CORT病毒模型組細胞相比，NF-κB抑制劑 BAY11-7082顯著降低了細胞中 NF-κB表達水平，同時TNF-α與IL-6釋放減少，提示CORT能直接激活體內的NF-κB信號誘導炎癥反應。但是BAY11-7082對CORT負荷的A549細胞感染流感病毒后NP與IFN-β表達無影響，說明細胞中IFN-β應答受MAVS調控而與NF-κB

10、信號通路無關。以上結果表明拘束應激負荷誘導的應激激素CORT一方面抑制了MAVS抗病毒信號通路減少 IFN-β應答，另一方面直接激活NF-κB信號通路誘導了炎癥因子釋放，兩者共同作用提高了機體流感“易感性”。
　　再次，MAVS抗病毒信號減弱是拘束應激負荷誘導應激激素CORT降低流感病毒“易感性”的重要機制。流感病毒能利用蛋白泛素化途徑調控機體先天性免疫信號轉導，而線粒體融合蛋白2（Mitofusin2。Mfn2）能夠抑制MAVS

11、抗病毒信號降低 IFN應答促進病毒感染。因此，本課題從拘束應激負荷與 CORT負荷對小鼠基因表達譜的影響，與體內MAVS泛素化角度研究和探討Mfn2在應激激素CORT調控MAVS泛素化中的作用。（1）首先采用小鼠表達譜測序對拘束應激負荷與CORT負荷小鼠進行基因表達水平的檢測，發(fā)現CORT負荷能夠明顯上調小鼠肺組織中與先天性免疫及抗病毒相關的Vdac1、Irf3、Mfn2與Jun基因水平，其中Mfn2基因水平顯著上調，但是MAVS基因水

12、平無明顯影響，提示拘束應激負荷與CORT負荷增強機體易感性可能與Mfn2有關。接下來采用RT-PCR與western blot方法檢測拘束應激負荷與CORT負荷對小鼠與A549細胞中Mfn2與MAVS的基因與蛋白表達影響。體內外實驗結果顯示，CORT負荷能增強Mfn2基因與蛋白表達，對MAVS基因表達無影響，但是降低MAVS蛋白表達，提示Mfn2可能與應激激素 CORT提高機體流感“易感性”相關。（2）采用pIRES2-EGFP-Mfn

13、2質粒轉染A549細胞，探討過表達Mfn2對流感感染機體“易感性”的影響。質粒轉染的A549細胞經CORT負荷后感染H1N1病毒，觀察細胞中NP，IFN-β與IFITM3蛋白表達變化。實驗結果表明過表達Mfn2細胞感染流感病毒后NP表達顯著增強，IFN-β與IFITM3蛋白表達下降，說明應激激素CORT上調了Mfn2表達從而抑制了IFN-β應答。（3）進一步考察Mfn2在CORT調控 MAVS信號通路降低 IFN-β應答中的作用。采用免

14、疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,Co-IP）實驗驗證Mfn2與MAVS在體內相互作用，結果證明了Mfn2與MAVS在細胞體內相互結合。采用Co-IP與western blot法相結合測定應激激素CORT對病毒感染小鼠肺組織中MAVS泛素化的影響。實驗結果表明，與病毒組相比，拘束應激負荷與CORT負荷小鼠肺組織中MAVS泛素化顯著增強，以上結果提示Mfn2可能通過促進MAVS泛素化抑制機體抗病毒信號通路。（4）采用

15、pIRES2-EGFP-Mfn2質粒轉染A549細胞，觀察過表達Mfn2對CORT負荷A549細胞感染病毒后MAVS泛素化的影響。實驗結果顯示，Mfn2過表達促進了A549細胞感染病毒后MAVS泛素化，提示應激激素CORT通過上調Mfn2促進了MAVS泛素化降解。
　　最后，考察Mfn2調控MAVS信號通路在天然小分子活性肽肌肽（Carnosine）保護拘束應激負荷小鼠流感感染中的作用研究。課題組前期建立拘束負荷小鼠流感易感性模型

16、，并用此模型評價出了許多天然產物對流感易感性的保護作用。其中，課題組前期研究發(fā)現天然小分子活性肽 carnosine具有抗應激與抗氧化等多種生理活性，且能夠提高流感感染小鼠的存活率，但是 carnosine降低流感小鼠易感性是否與Mfn2調控MAVS信號通路有關尚未闡明。（1）采用拘束應激負荷小鼠感染流感病毒，觀察流感小鼠肺指數、病毒復制及肺部病理損傷情況。實驗結果顯示，carnosine顯著降低了拘束負荷小鼠感染流感病毒后的肺指數與病

17、毒復制水平，減輕了肺部病理損傷。以上結果說明小分子活性肽 carnosine能夠對流感感染的應激負荷小鼠發(fā)揮保護作用。（2）探討 carnosine降低拘束應激負荷小鼠流感易感性是否與影響 MAVS抗病毒信號通路有關。觀察應激負荷小鼠感染流感后肺組織中IFN-β應答與MAVS、p-IRF3、NF-κB與p-IκB蛋白表達變化情況。實驗結果表明，與模型組相比，carnosine增強了流感小鼠肺組織中 IFN-β與IFITM3蛋白表達，上調

18、了MAVS與p-IRF3蛋白表達水平，同時降低了NF-κB與p-IκB蛋白水平。以上結果說明carnosine能夠激活MAVS抗病毒信號通路促進IFN-β應答從而降低機體流感易感性。（3）探討Mfn2調控MAVS抗病毒活性在 carnosine降低機體流感易感性中的作用。觀察應激負荷小鼠感染流感后肺組織中MAVS與MAVS聚集體及Mfn2蛋白表達變化。實驗結果顯示，與模型組相比，carnosine提高了流感小鼠肺組織中MAVS與MAVS