NDV 7793抑制小鼠肺腺癌皮下移植瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移.pdf

1、研究背景和目的：
　　新城疫病毒（Newcasle disease virus，NDV）治療腫瘤作為一種潛在的生物治療方法，已經(jīng)逐漸用于腫瘤治療的基礎(chǔ)和臨床研究。我們?cè)诮髹蛾?yáng)湖野鴨中分離得到NDV野生毒株（命名為WDK/JX/7793/2004，簡(jiǎn)稱(chēng)NDV7793），依據(jù)多重RT-PCR電泳和基因序列分析結(jié)果確定其為NDV弱毒株的一員。我們課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NDV7793瘤內(nèi)注射可明顯抑制人小細(xì)胞肺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，

2、該作用可能與其上調(diào)腫瘤細(xì)胞Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)；還發(fā)現(xiàn)NDV7793腹腔注射，對(duì)小鼠結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移同樣具有明顯的抑制作用，這可能是通過(guò)糾正腫瘤微環(huán)境中Th1/Th2細(xì)胞比例失衡，以及通過(guò)提高胸腺指數(shù)等途徑來(lái)抑制結(jié)腸癌的肝轉(zhuǎn)移。
　　然而，NDV7793瘤內(nèi)注射，除通過(guò)改變皮下移植瘤腫瘤微環(huán)境來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用外，尚未明確NDV7793瘤內(nèi)注射能對(duì)皮下移植瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。本課題旨在研究NDV7793瘤內(nèi)注射對(duì)小鼠肺腺癌皮下

3、移植瘤的治療效果；初步探討NDV7793瘤內(nèi)注射對(duì)小鼠肺腺癌皮下移植瘤腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　研究?jī)?nèi)容和方法：
　　1.通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NDV7793對(duì)LLC細(xì)胞的殺傷作用體外培養(yǎng)LLC細(xì)胞，分別將不同效價(jià)的NDV7793及不同濃度的順鉑進(jìn)行分組處理，作用時(shí)間結(jié)束，加入CCK-8試劑，檢測(cè)各組細(xì)胞OD值。
　　2.小鼠肺腺癌皮下移植瘤模型的建立
　　常規(guī)培養(yǎng)小鼠肺腺癌Lewis細(xì)胞（簡(jiǎn)稱(chēng)LL

4、C）。小鼠右腋皮下注射1×106個(gè)LLC細(xì)胞建立肺腺癌皮下移植瘤模型。
　　3.研究NDV7793對(duì)小鼠肺腺癌皮下移植瘤的療效
　　分組給藥：將肺腺癌皮下移植瘤模型小鼠隨機(jī)分為PBS陰性對(duì)照組，順鉑陽(yáng)性對(duì)照組，NDV7793組。用重復(fù)測(cè)量法分析各組藥物對(duì)小鼠腫瘤體積的影響，對(duì)各組小鼠進(jìn)行生存分析，比較各組抑瘤率。
　　4.觀察腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移情況
　　比較小鼠右腋下淋巴結(jié)、皮下癌旁組織腫瘤浸潤(rùn)及胸腔轉(zhuǎn)移情況。

5、>　　5.檢測(cè)小鼠腫瘤組織CCL19、CCL21表達(dá)水平
　　ELISA方法分別檢測(cè)腫瘤組織上清液CCL19、CCL21表達(dá)水平。
　　6. NDV7793對(duì)肺腺癌皮下移植瘤模型小鼠腫瘤組織T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)、LLC細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)的影響
　　流式分別檢測(cè)腫瘤組織T細(xì)胞占TILs細(xì)胞比例、CCR7+LLC細(xì)胞占LLC細(xì)胞比例及CCR7+T細(xì)胞占T細(xì)胞比例。
　　7.分析各組小鼠腫瘤組織CCL2

6、1表達(dá)水平與T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)、LLC細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)的關(guān)系
　　將所有組別的小鼠腫瘤組織T細(xì)胞/TILs細(xì)胞比例、CCR7+LLC細(xì)胞/LLC細(xì)胞比例及CCR7+T細(xì)胞/T細(xì)胞比例分別與腫瘤組織CCL21水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　8.分析各組小鼠腫瘤組織LLC細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)與T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)的關(guān)系
　　將小鼠腫瘤組織CCR7+LLC細(xì)胞/LLC細(xì)胞比例分別與CCR7+ T細(xì)

7、胞/T細(xì)胞比例、T細(xì)胞/TILs比例進(jìn)行相關(guān)分析。
　　9.檢測(cè)腫瘤組織CEACAM1蛋白的表達(dá)水平
　　流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組腫瘤組織CEACAM1+細(xì)胞占腫瘤組織細(xì)胞比例；免疫組化實(shí)驗(yàn)比較各組小鼠腫瘤組織CEACAM1表達(dá)水平。
　　10.分析腫瘤組織CEACAM1表達(dá)水平與CCL21蛋白表達(dá)、T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞C C R7蛋白表達(dá)、L L C細(xì)胞C C R7蛋白表達(dá)的關(guān)系
　　將所有組別的小鼠腫瘤組織CEACA

8、M1+細(xì)胞占腫瘤組織細(xì)胞比例分別與CCL21蛋白表達(dá)、T細(xì)胞/TILs細(xì)胞比例、CCR7+LLC細(xì)胞/LLC細(xì)胞比例及CCR7+T細(xì)胞/T細(xì)胞比例進(jìn)行相關(guān)分析。
　　研究結(jié)果：
　　1.作用時(shí)間為48小時(shí)，不同效價(jià)的NDV7793和不同濃度的順鉑均對(duì)LLC細(xì)胞有殺傷作用，其中NDV7793組（最低效價(jià)1:64）和順鉑組（最低濃度0.0025mg/mL）的OD值均小于空白對(duì)照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.

9、成功構(gòu)建小鼠肺腺癌皮下移植瘤模型，建模成功率為96％（48/50）。
　　3. NDV7793對(duì)小鼠肺腺癌皮下移植瘤的治療效果
　　1）對(duì)腫瘤體積生長(zhǎng)分析可得：給藥期間，與PBS陰性對(duì)照組相比，NDV7793組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組可減緩小鼠腫瘤體積的生長(zhǎng)速率，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且NDV7793組較順鉑陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)小鼠腫瘤體積生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)。
　　2）對(duì)各組小鼠進(jìn)行生存分析可得：NDV7793組生存期顯著

10、長(zhǎng)于PBS陰性對(duì)照組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但順鉑陽(yáng)性對(duì)照組的生存期與PBS陰性對(duì)照組相比較，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3）對(duì)各組抑瘤率統(tǒng)計(jì)分析可得：給藥期間，與PBS陰性對(duì)照組比較，NDV7793組和順鉑陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腫瘤均被抑制，且NDV7793組的抑瘤率高于順鉑陽(yáng)性對(duì)照組。
　　4. NDV7793對(duì)小鼠肺腺癌皮下移植瘤癌旁組織、右腋下淋巴結(jié)浸潤(rùn)及胸腔轉(zhuǎn)移的影響
　　病理學(xué)觀察：PBS陰性

11、對(duì)照組小鼠癌旁組織均發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)，且部分小鼠癌細(xì)胞已浸潤(rùn)到小鼠右腋下淋巴結(jié)；順鉑陽(yáng)性對(duì)照組部分小鼠癌旁組織發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)，右腋下淋巴結(jié)未見(jiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)；NDV7793組小鼠，癌細(xì)胞未浸潤(rùn)癌旁組織及右腋下淋巴結(jié)。三組小鼠均未發(fā)生胸腔內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　5.腫瘤組織CCL21表達(dá)水平顯示：NDV7793組小鼠腫瘤組織的CCL21表達(dá)水平明顯高于PBS陰性對(duì)照組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，順鉑陽(yáng)性對(duì)照組與PBS陰性對(duì)照組相近，P＞0.

12、05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.腫瘤組織CCL19表達(dá)水平顯示：PBS陰性對(duì)照組、NDV7793組及順鉑陽(yáng)性對(duì)照組CCL19表達(dá)水平無(wú)明顯差異，且腫瘤組織的CCL19表達(dá)水平較CCL21表達(dá)水平低。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織LLC細(xì)胞CCR7表達(dá)結(jié)果顯示：與PBS陰性對(duì)照組相比，NDV7793組小鼠腫瘤組織CCR7+LLC細(xì)胞占LLC細(xì)胞比例下降，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而順鉑陽(yáng)性對(duì)照組與PBS組比例相近，

13、P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明NDV7793組較PBS陰性對(duì)照組及順鉑陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腫瘤組織LLC細(xì)胞CCR7表達(dá)水平更弱。
　　8.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織T細(xì)胞浸潤(rùn)情況及T細(xì)胞CCR7表達(dá)結(jié)果顯示：NDV7793組T細(xì)胞/TILs比例大于PBS陰性對(duì)照組及順鉑陽(yáng)性對(duì)照組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而NDV7793組及順鉑陽(yáng)性對(duì)照組CCR7+T細(xì)胞/T細(xì)胞比例明顯小于PBS陰性對(duì)照組，P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

14、
　　9.分析各組小鼠腫瘤組織CCL21表達(dá)水平與T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)、LLC細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)的關(guān)系：結(jié)果表明CCL21表達(dá)水平與CCR7+LLC細(xì)胞/LLC細(xì)胞比例呈明顯負(fù)相關(guān)，r=一0.589，P＜0.01，相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與T細(xì)胞/TILs比例、CCR7+ T細(xì)胞/T細(xì)胞比例無(wú)關(guān)。
　　10.分析各組小鼠腫瘤組織LLC細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)與T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)的關(guān)系：結(jié)果表明小鼠腫

15、瘤組織CCR7+LLC細(xì)胞/LLC細(xì)胞比例與T細(xì)胞/TILs比例呈負(fù)相關(guān)，r=一0.503，P＜0.05，相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與CCR7+T細(xì)胞/T細(xì)胞比例無(wú)關(guān)。
　　11.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤組織CEACAM1表達(dá)水平顯示：NDV7793組小鼠腫瘤組織的CEACAM1+細(xì)胞/腫瘤組織細(xì)胞比例低于PBS陰性對(duì)照組（P＞0.05），低于順鉑陽(yáng)性對(duì)照組（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　12.免疫組化檢測(cè)腫瘤組織CEAC

16、AM1表達(dá)水平顯示：順鉑陽(yáng)性對(duì)照組小鼠腫瘤組織CEACAM1表達(dá)水平較PBS陰性對(duì)照組及NDV7793組強(qiáng)，且NDV7793組較PBS陰性對(duì)照組小鼠腫瘤組織CEACAM1的表達(dá)水平更弱。
　　13.分析各組小鼠腫瘤組織CEACAM1與CCL21表達(dá)水平、T細(xì)胞浸潤(rùn)、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)、LLC細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)的關(guān)系：結(jié)果表明小鼠腫瘤組織CEACAM1+細(xì)胞/腫瘤組織細(xì)胞比例與T細(xì)胞/TILs比例呈明顯負(fù)相關(guān)（r=一0.601

17、，P＜0.01），與CCR7+LLC細(xì)胞/LLC細(xì)胞比例呈明顯正相關(guān)（r=0.584，P＜0.01），相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與CCL21、T細(xì)胞CCR7蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1. NDV7793和順鉑對(duì)LLC細(xì)胞均具有殺傷作用。
　　2. NDV7793對(duì)肺腺癌皮下移植瘤小鼠的療效比順鉑更好，不僅延長(zhǎng)小鼠生存期及抑制腫瘤生長(zhǎng)，而且對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移也有一定的抑制作用。
　　3. NDV7793對(duì)肺腺癌皮