RNAi抑制CAR基因?qū)θ朔西[癌細(xì)胞系NCI-H520裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響.pdf

1、目的:
　　 利用RNAi干擾技術(shù)，干預(yù)人高表達(dá)柯薩奇病毒腺病毒受體(coxsackievirusand adenovirus receptor，CAR)肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞系中CAR的表達(dá)，通過(guò)體外細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物模型的構(gòu)建，觀察比較干預(yù)前后肺鱗癌細(xì)胞體外增殖活性的變化和裸鼠體內(nèi)成瘤率及對(duì)瘤體生長(zhǎng)等方面的影響，進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)CAR與肺癌的關(guān)系。
　　 方法:
　　 1將針對(duì)CAR mRNA序列設(shè)計(jì)的

2、小干擾RNA重組質(zhì)粒分別以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至人肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞，并經(jīng)G418抗性篩選得到穩(wěn)定細(xì)胞系。
　　 2采用半定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)3個(gè)穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系和陰性對(duì)照、空白對(duì)照組細(xì)胞中CAR mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，判斷抑制效果并篩選出抑制效果最佳的一組穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
　　 3用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察RNA干擾抑制CAR基因表達(dá)對(duì)NCI-H520肺鱗癌細(xì)胞系體外增殖能力的影響。

3、>　　 4通過(guò)繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，動(dòng)態(tài)觀察瘤體的生長(zhǎng)，進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)證CAR對(duì)肺癌的增殖是否有促進(jìn)作用。
　　 結(jié)果:
　　 1篩選出了抑制CAR基因表達(dá)效果最佳的一組shRNA，并建立了能穩(wěn)定而有效抑制CAR基因表達(dá)的肺鱗狀細(xì)胞癌NCI-H520細(xì)胞系。
　　 2利用半定量RT-PCR和Western blot檢測(cè)方法結(jié)果顯示，三組穩(wěn)定細(xì)胞系中CARmRNA水平和蛋白質(zhì)含量均有不同程度的下降。其中shRNA-2抑制

4、作用最強(qiáng)，其對(duì)CAR mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制率分別達(dá)到82.5％和79.8％，本研究選用shRNA2重組質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
　　 3關(guān)于CAR與肺癌腫瘤細(xì)胞體外增殖能力的關(guān)系，本研究在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染shRNA-2質(zhì)粒的NCI-H520細(xì)胞抑制CAR基因表達(dá)后，其體外增殖能力稍有下降，但是其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其原因和機(jī)制有待于進(jìn)一步分析和研究。
　　 4在腫瘤形成實(shí)驗(yàn)中，裸鼠肺癌移植模型

5、構(gòu)建成功，為以后肺癌的研究奠定基礎(chǔ)。與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，利用RNAi干擾有效抑制了CAR基因的表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤增殖能力與空白對(duì)照組和陰性載體對(duì)照組相比，瘤體生長(zhǎng)減緩，移植瘤體積、重量明顯減小(P＜0.01)。說(shuō)明沉默CAR基因的表達(dá)后，該組裸鼠的腫瘤形成能力明顯降低了，進(jìn)一步說(shuō)明了CAR基因與肺癌的增殖能力有密切關(guān)系。
　　 結(jié)論:
　　 裸鼠肺癌移植模型構(gòu)建成功，為以后肺癌的研究奠定基礎(chǔ)。利用RNAi干