貝伐單抗聯(lián)合順鉑對(duì)荷人肺腺癌A549-DDP裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響.pdf

1、肺癌是當(dāng)今世界對(duì)人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，約70％-80％的患者初診時(shí)已屬疾病中、晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。雖然輔助化療在防治復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等方面具有確切療效，新的化療藥物也在不斷問(wèn)世，但對(duì)于晚期非手術(shù)肺癌患者的療效仍維持在較低的水平，有效率僅20％-40％，5年生存率只有15％。特別是非小細(xì)胞肺癌(non small cell lungcancer，NSCLC)對(duì)化療藥物不敏感，其原因之一即由于癌細(xì)胞內(nèi)在的

2、和(或)獲得性多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)的產(chǎn)生?；熌退幰殉闪四[瘤治療中的主要障礙，臨床上迫切需要有新的方法用于肺癌治療。研究表明在大多數(shù)人類腫瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF表達(dá)均上調(diào)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可特異作用于內(nèi)皮細(xì)胞刺激新生血管形成，影響腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后<'[1,2]>。新生血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的必需條件

3、，而破壞或抑制腫瘤血管生成即是抗血管生成療法的目標(biāo)。貝伐單抗(Bevacizumab，Avastin)是一種重組人源化單克隆抗體，通過(guò)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因了高親和力結(jié)合，阻斷血管生成而發(fā)揮抗腫瘤作用。臨床前研究發(fā)現(xiàn)，在不考慮給藥方式或接種部位的情況下，單藥貝伐單抗在20種(13個(gè)腫瘤類型)不同的人腫瘤裸鼠移植瘤模型中均能拮抗腫瘤的生長(zhǎng)，個(gè)別實(shí)驗(yàn)還觀察到有顯著的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。貝伐單抗作為第一個(gè)被美國(guó)藥品和食品管理局(FDA)批準(zhǔn)通過(guò)用于

4、抑制血管生成發(fā)揮抗癌作用的藥物，無(wú)論是單獨(dú)或與其它化療藥物聯(lián)用，均可以減少腫瘤血管生成，取得較好臨床療效。目前貝伐單抗正應(yīng)用于一系列Ⅱ/Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并在非小細(xì)胞肺癌<'[3]>、結(jié)直腸癌<'[4]>和腎癌<'[5]>中取得了令人鼓舞的結(jié)果。我們的目的是研究貝伐單抗對(duì)荷人肺腺癌A549/DDP(順鉑耐藥表型)移植瘤生長(zhǎng)抑制的效果，提供臨床前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為建立肺癌生物化療的新模式奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容如下： 1．鑒定耐順鉑人肺腺癌A549/DD

5、P細(xì)胞的耐藥特性并分析其耐藥機(jī)制，將A549/DDP耐藥細(xì)胞接種入裸鼠體內(nèi)以建立荷A549/DDP裸鼠皮下移植瘤模型。 2．初步探討VEGF單克隆抗體貝伐單抗聯(lián)合或不聯(lián)合順鉑對(duì)荷A549/DDP裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的影響。 方法： 1．進(jìn)行三種細(xì)胞(A549、A549/DDP、SKOV-3、)的傳代培養(yǎng)，以備實(shí)驗(yàn)用。采用MTT法描繪A549親本細(xì)胞和A549/DDP耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀比較A549親本細(xì)胞

6、和A549/DDP耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期；兩株細(xì)胞用順鉑誘導(dǎo)24小時(shí)再經(jīng)AnrlexinV和PI雙染后檢測(cè)比較細(xì)胞平均凋亡率的差異；MTT法計(jì)算A549/DDP耐藥細(xì)胞與A549親本細(xì)胞對(duì)順鉑的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)和耐藥系數(shù)(RI)；檢測(cè)A549/DDP耐藥細(xì)胞對(duì)其它5種臨床常用化療藥物(卡鉑、長(zhǎng)春新堿、表阿霉素、吉西他濱及紫杉醇)的交叉耐藥譜；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進(jìn)一步分析A549和A549/DDP兩種細(xì)胞

7、系關(guān)于VEGF、凋亡基因(bc1-2)及耐藥基因(MDR1、LRP、GST-π的mRNA表達(dá)情況。 2．建立腫腺癌耐藥細(xì)胞A549/DDP裸鼠皮下移植瘤模型，將25只荷A549/DDP移植瘤裸鼠隨機(jī)分成5組進(jìn)行藥物治療(瘤直徑至少為5mm)。具體治療如下：①空白對(duì)照組(A組)：無(wú)菌生理鹽水；②單藥貝伐單抗組(B組)：5mg/kg；③單藥順鉑組(C組)：4mg/kg；④聯(lián)合1組(D組)：貝伐單抗5mg/kg+順鉑4mg/kg；⑤聯(lián)

8、合2組(E組)：貝伐單抗5mg/kg+順鉑2mg/kg。其中，經(jīng)順鉑治療組(C、D、E組)于用藥前30分鐘皮下注射賽格恩(3mg/kg)預(yù)防胃腸道反應(yīng)。均為腹腔注射(0.5ml/只/次)，2次/周，連續(xù)用藥4周，觀察裸鼠移植瘤生長(zhǎng)狀況。停藥1周后處死各組裸鼠，稱重并收集皮下移植瘤標(biāo)本測(cè)量瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率；免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry,IHC)檢測(cè)各組移植瘤組織的微血管密度(microvessel densi

9、ty,MVD)；RT-PCR 進(jìn)一步分析各組經(jīng)藥物治療后凋亡基因bc1-2及耐藥基因(LRP、GST-π)mRNA的表達(dá)情況。3．實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以"均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差"表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)各結(jié)果進(jìn)行分析。兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期差異及凋亡基因bc1-2及耐藥基因(MDR1、LRP、GST-π)mRNA的表達(dá)情況均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；經(jīng)順鉑藥物誘導(dǎo)前后細(xì)胞平均凋亡率的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；藥物敏感性實(shí)驗(yàn)采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)；三種

10、細(xì)胞(A549、A549/DDP、SKOV-3)VEGFmRNA的表達(dá)情況采用Dunnett法(SKOV-3為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞)；各動(dòng)物實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率、微血管密度及各組移植瘤組織中凋亡基因bc1-2及耐藥基因(LRP、GST-π)mRNA的表達(dá)情況均采用One-way ANOVA單向方差分析(Least-significant-Difference,LSD法)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1．細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，

11、A549細(xì)胞和A549/DDP耐藥細(xì)胞在細(xì)胞增殖方面存在一定差異。A549/DDP耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)較親本細(xì)胞快，指數(shù)生長(zhǎng)期早于A549細(xì)胞。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，A549/DDP耐藥細(xì)胞與A549親本細(xì)胞在細(xì)胞周期上有顯著差異，前者 S 期細(xì)胞增多(5 1.73±0.44)％，(P<0.001)，95％可信區(qū)間為[36.07，37.94]，G1期細(xì)胞減少(37.25±0.21)％，(P<0.001)，95％可信區(qū)間為[43.30，44.18

12、]，提示A549/DDP耐藥細(xì)胞DNA合成增加。A549親本細(xì)胞經(jīng)順鉑(10μg/ml)誘導(dǎo)24小時(shí)后細(xì)胞凋亡率從原來(lái)的(5.32±0.19)％增加到(34.57±2.24)％，(P=0.002)，95％可信區(qū)間為[24.15，34.36]，有顯著的凋亡效應(yīng)；而A549/DDP耐藥細(xì)胞經(jīng)藥物作用前后平均凋亡率差異僅(0.46±0.25)％，(P=0.086)，無(wú)明顯變化，可見(jiàn)順鉑誘導(dǎo)兩種細(xì)胞凋亡之間有顯著差異(P<0.001)。A549

13、親本細(xì)胞和A549/DDP耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑的IC<,50>分別為(5.35±0.37)μ M/L、(92.88±4.10)μM/L(P=0.001)，耐藥系數(shù)(RI)為17.36。交叉耐藥實(shí)驗(yàn)表明，A549/DDP耐藥細(xì)胞對(duì)卡鉑(CBP)、表阿霉素(EPI)及紫杉醇(TAX)的耐藥系數(shù)分別為6.23、4.64和20.80，(P≤0.002)，而對(duì)長(zhǎng)春新堿(RI=1.39)和吉西他濱(RI=1.09)則無(wú)交叉耐藥；半定量RT-PCR結(jié)果顯示

14、，在A549/DDP耐藥細(xì)胞中bc1-2、LRP、GST-πmRNA的表達(dá)均較A549親本細(xì)胞顯著增高(P<0.001)，而MDR1mRNA未見(jiàn)表達(dá)；同時(shí)通過(guò)與SKOV-3細(xì)胞對(duì)比亦證實(shí)A549親本細(xì)胞和A549/DDP耐藥細(xì)胞均高表達(dá)VEGF。2. 治療結(jié)束后順鉑常規(guī)劑量組(C、D組)裸鼠體重較其它各組均減輕(P≤0.001)，而其余各組之間體重?zé)o顯著差異(P=0.928)。與空白對(duì)照組相比，經(jīng)貝伐單抗治療組(B、D、E組)的移植瘤生

15、長(zhǎng)顯著受到抑制，其抑瘤率分別為20.96％、51.67％、50.95％，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且聯(lián)合用藥組(D、E組)作用最佳，單藥順鉑組抑瘤率僅為0.30％，與對(duì)照組之間無(wú)顯著差異(P=0.632)，兩個(gè)聯(lián)合用藥組之間的抑瘤率也無(wú)差異(P=0.262)；經(jīng)貝伐單抗治療組(B、D、E組)的微血管密度表達(dá)顯著下降(分別為18.6±1.14、13.6±1.14、14.4±0.55)，P值均<0.001；同時(shí)RT-PCR結(jié)果亦

16、顯示，與空白對(duì)照組相比，經(jīng)貝伐單抗治療組(B、D、E組)bc1-2mRNA表達(dá)下調(diào)(P<0.001)，但該三組之間無(wú)差異，實(shí)驗(yàn)各組之間在耐藥基因 LRP、GST-πmRNA表達(dá)上均未見(jiàn)顯著差異。 結(jié)論： 1．經(jīng)鑒定耐順鉑人腫腺癌A549/DDP細(xì)胞具有多重耐藥性，其細(xì)胞生物學(xué)性狀的改變可能與之相關(guān)。該細(xì)胞抗藥性能明顯、穩(wěn)定，同時(shí)A549/DDP耐藥細(xì)胞VEGF(為貝伐單抗的治療靶點(diǎn))高表達(dá)，非常適合用于本實(shí)驗(yàn)研究。