(TiTaNbZr)90Mo10合金對(duì)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、目的：
　　顳下頜關(guān)節(jié)疾病長期以來一直困擾著人們，對(duì)于顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直、顳下頜關(guān)節(jié)腫瘤、髁突粉碎性骨折等顳下頜關(guān)節(jié)疾病，藥物治療雖然能緩解疼痛，卻不能從根本上提升關(guān)節(jié)的功能。而人工關(guān)節(jié)置換卻可以達(dá)到解決這些問題的目的。目前臨床上常用的人工關(guān)節(jié)材料主要有CoCrMo合金、人工陶瓷以及超高分子量聚乙烯。但是，CoCrMo人工關(guān)節(jié)容易發(fā)生無菌性松動(dòng)，人工陶瓷容易發(fā)生破碎，超高分子量聚乙烯耐磨性差。因此，中科院金屬研究所研制出一種新型的人工

2、關(guān)節(jié)材料--(TiZrNbTa)90Mo10合金，它具有與鑄態(tài)CoCrMo合金相當(dāng)?shù)木C合力學(xué)性能，有較強(qiáng)的耐磨性和耐腐蝕性，并具有良好的生物相容性，沒有毒性離子釋放，期望成為替代鑄態(tài)CoCrMo合金的備選材料。(TiTaNbZr)90Mo10作為一種新型醫(yī)用合金極具應(yīng)用前景，其生物相容性亟待評(píng)價(jià)。生物相容性是金屬材料的生物特性的醫(yī)學(xué)研究的重要組成部分，目前，人們?cè)谑褂眯虏牧锨岸夹枰?jīng)過生物相容性測(cè)試。本實(shí)驗(yàn)從生物學(xué)角度，以純鈦為對(duì)照，因

3、為純鈦為目前臨床公認(rèn)的生物相容性較好的材料，通過比較大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在(TiTaNbZr)90Mo10及純鈦表面的增殖分化來探究(TiTaNbZr)90Mo10的生物相容性。
　　方法：
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　細(xì)胞原代培養(yǎng)選擇SD大鼠，提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂肪誘導(dǎo)染色的鑒定，并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度。
　　2、細(xì)胞粘附
　　按照2×104個(gè)細(xì)胞/片的密度接種后

4、培養(yǎng)24小時(shí)，通過掃描電鏡觀察細(xì)胞在材料表面的粘附情況。按照4×104個(gè)細(xì)胞/片的密度接種后培養(yǎng)3小時(shí)、24小時(shí)，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面的粘附情況。
　　3、細(xì)胞增殖
　　以2×104個(gè)細(xì)胞/片的密度接種，放于24孔板中培養(yǎng)1、3、5、7天，應(yīng)用阿爾瑪藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞在材料表面的增殖。
　　4、細(xì)胞分化
　　以2×104個(gè)細(xì)胞/片的密度接種，放于24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞長至70％匯合度，加入成骨誘導(dǎo)劑，分別誘導(dǎo)1、

5、4、7、14天測(cè)堿性磷酸酶的變化;誘導(dǎo)14、21天測(cè)骨鈣素的變化;誘導(dǎo)21天進(jìn)行茜素紅染色定性定量檢測(cè)材料表面的成骨礦化量。細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/片的密度接種于6孔板的金屬片上，誘導(dǎo)4、7、14天，對(duì)Runx2、COLⅠ、OCN、OPN進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1、細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定
　　顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為典型的長梭形或多角形形態(tài)，融合的細(xì)胞呈典型的螺旋狀生長趨勢(shì)，

6、符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的典型形態(tài)和生長特點(diǎn)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行成骨、成脂肪誘導(dǎo)后染色，堿性磷酸酶染色顯示，細(xì)胞質(zhì)成藍(lán)色;VonKossa染色顯示，有大量礦化顆粒產(chǎn)生;油紅O染色顯示，有紅色脂滴形成。流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，細(xì)胞表面高表達(dá)CD90和CD44標(biāo)志物，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面的CD11b和CD45標(biāo)志物。以上均表明所提取的細(xì)胞為未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　　2、掃描電鏡和熒光顯微鏡結(jié)果
　　掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞接種24小時(shí)

7、以后，細(xì)胞在兩種材料表面均鋪展良好并且均有大量絲狀偽足伸展出，說明兩種材料均有助于細(xì)胞在其表面的粘附。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞接種于材料表面3小時(shí)后，兩種材料表面的細(xì)胞均剛剛鋪展開，并且在細(xì)胞周圍均有粘著斑蛋白產(chǎn)生。接種24小時(shí)后，兩種材料表面的細(xì)胞均鋪展良好并且在細(xì)胞周圍也均有粘著斑蛋白產(chǎn)生。觀察結(jié)果表明，兩種材料均有助于細(xì)胞在其表面粘附。
　　3、AlamarBlue檢測(cè)結(jié)果
　　隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，兩種材料表面的細(xì)胞活

8、性呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)(p＜0.05)，并于第5天發(fā)現(xiàn)(TiTaNbZr)90Mo10表面的細(xì)胞活性高于cp-Ti(p＜0.05)。
　　4、ALP定量檢測(cè)結(jié)果
　　細(xì)胞培養(yǎng)1、4、7、14天后，雖然(TiTaNbZr)90Mo10表面的堿性磷酸酶活性稍高于純鈦，但兩組間并無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。從1到7天，兩種材料表面堿性磷酸酶的含量呈遞增趨勢(shì)(p＜0.05)，說明兩種材料均有利于間充質(zhì)干細(xì)胞的早期成骨分化。并且在成骨

9、誘導(dǎo)第14天發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性明顯降低(p＜0.05)，說明此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)分化為較成熟的成骨細(xì)胞。
　　5、OCN定量檢測(cè)結(jié)果
　　于成骨誘導(dǎo)14、21天，兩種材料表面的骨鈣素的量隨時(shí)間增加而增多(p＜0.05)，雖然(TiTaNbZr)90M010表面的骨鈣素含量稍高于純鈦表面，但是兩種材料表面的骨鈣素量無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　6、茜素紅染色結(jié)果
　　體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，兩種材料表面均有鈣鹽沉

10、積，并且鈣結(jié)節(jié)被茜素紅染成紅色。定量結(jié)果顯示，(TiTaNbZr)90Mo10表面的細(xì)胞礦化量稍高于純鈦表面的礦化量，但是兩種材料表面的礦化量并無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)。
　　7、Real-time PCR結(jié)果
　　隨著成骨誘導(dǎo)的時(shí)間增加，Runx2持續(xù)表達(dá)，COLⅠ呈遞減趨勢(shì)(p＜0.05)，OCN、OPN呈遞增趨勢(shì)(p＜0.05)，并且這4種蛋白基因的表達(dá)量在兩種材料表面并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(p＞0.05)。<