金黃色葡萄球菌中基于dCas9的基因敲低系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、金黃色葡萄球菌是引起人畜機會性感染的一類重要病原體。它在環(huán)境中以及人體皮膚和粘膜表面都普遍存在，能引發(fā)多種高發(fā)病率和高死亡率的感染性疾病，嚴重危害人類健康。對金黃色葡萄球菌的分子遺傳學(xué)研究能解析其毒性，致病性與耐藥性相關(guān)的分子機理，有助于發(fā)現(xiàn)針對其感染性疾病的新的藥物靶點和治療手段。但金黃色葡萄球菌中現(xiàn)有的研究特定基因功能的遺傳學(xué)操作技術(shù)都存在效率低、過程繁瑣等問題，而且一直缺乏一種簡便高效的基因敲低技術(shù)。
　　本課題中我們基于R

2、NA介導(dǎo)的DNA結(jié)合蛋白dCas9構(gòu)建了一套簡單高效的金黃色葡萄球菌基因敲低系統(tǒng)CRISPRi，通過共表達dCas9和一段引導(dǎo)RNA（sgRNA）就可以實現(xiàn)對目標基因的特異性敲低。而利用ATc誘導(dǎo)的啟動子控制dcas9基因的表達使得該系統(tǒng)對基因的敲低具有可誘導(dǎo)性。同時我們采用了一種特殊的克隆sgRNA表達框的方法，使得敲低質(zhì)粒的構(gòu)建十分簡便。
　　利用CRISPRi系統(tǒng)，我們實現(xiàn)了對金黃色葡萄球菌不同菌株中不同大小不同表達水平基因

3、的成功敲低，并證實該系統(tǒng)也能有效地用于必需基因的功能研究。同時，我們發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)也能用于對操縱子中全部或部分基因的選擇性敲低。此外，通過同時表達多個sgRNA，該系統(tǒng)可實現(xiàn)多個基因的同時敲低以及單個基因的多重敲低。最后我們也探究了利用RNA介導(dǎo)的核酸內(nèi)切酶Cas9進行金黃色葡萄球菌基因組編輯的可行性，發(fā)現(xiàn)因為細菌自身DNA修復(fù)系統(tǒng)的低效導(dǎo)致Cas9并不適合用于金黃色葡萄球菌的基因組編輯。
　　CRISPRi系統(tǒng)能同時用于必需和非必需