青蒿琥酯對煙草煙霧暴露小鼠糖皮質(zhì)激素敏感性的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、研究目的：
　　第一部分:探究青蒿琥酯對煙草煙霧暴露小鼠肺氧化損傷的影響。
　　第二部分:探究青蒿琥酯對煙草煙霧暴露小鼠氣道炎癥和糖皮質(zhì)激素敏感性的影響及可能機制。
　　研究方法：
　　第一部分
　　無特定病原體(SPF)級雌性BALB/c小鼠40只，按隨機數(shù)字表法平均分為正常組、熏煙組、溶媒組和青蒿琥酯組。后3組小鼠被動吸煙40天(d)，溶媒組和青蒿琥酯組在熏煙前分別腹腔注射溶媒（5％ NaHCO3溶液含

2、5％二甲基亞砜，0.1 ml/只）和青蒿琥酯（30 mg/kg，溶于0.1ml溶媒中），正常組和熏煙組以等量生理鹽水作為對照。支氣管肺泡灌洗液(BALF)進行細胞分類計數(shù)，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測定BALF中白細胞介素(IL)-8、肺組織3-硝基酪氨酸(3-NT)水平;并檢測血清丙二醛水平、肺組織總超氧化物歧化酶(SOD)和總谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性;觀察肺組織病理學(xué)改變;Western印跡法測定肺組織核因子E2相關(guān)因子2

3、(Nrf2)蛋白表達。
　　第二部分
　　體內(nèi)實驗:SPF級BALB/c小鼠75只，按隨機數(shù)字表法平均分為正常組、煙霧哮喘組、溶媒組、青蒿琥酯組和地塞米松組。后四組小鼠被動吸煙40天，在第10、17、24天每只小鼠腹腔注射20μg OVA和4mg氫氧化鋁凝膠致敏，第31～40天每日霧化吸入1％OVA30分鐘(min)激發(fā)。正常組小鼠以正?？諝獯姹粍游鼰煟缘攘康纳睇}水代替OVA致敏和激發(fā)。在末次激發(fā)后，每組隨機抽取6只小

4、鼠測定氣道反應(yīng)性，以吸氣阻力(RI)、呼吸阻力(RE)和動態(tài)肺順應(yīng)性(Cydn)作為檢測指標(biāo)。各組余9只小鼠BALF行細胞分類計數(shù)，ELISA法檢測BALF中IL-4、IL-8、IL-13和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平;HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變;組蛋白去乙?；?(HDAC2)活性檢測試劑盒檢測肺組織HDAC2活性;Western印跡法測定肺組織PI3Kδ、PI3Kγ、p-Akt1、Akt1、p-HDAC2、HDAC2蛋白表達

5、。
　　體外實驗:培養(yǎng)人支氣管上皮細胞株BEAS-2B，分為對照組、CSE處理組、地塞米松組、青蒿琥酯地塞米松共同處理組和青蒿琥酯組。CSE孵育后四組細胞6h后，更換培養(yǎng)基，用TNF-α刺激細胞產(chǎn)生IL-8過夜。在TNF-α刺激前，地塞米松組、青蒿琥酯組細胞分別給予地塞米松(10-11～10-6M)、青蒿琥酯(10μM)處理1h，青蒿琥酯地塞米松共同處理組細胞用青蒿琥酯(10μM)聯(lián)合地塞米松（10-11～10-6M）處理1h。E

6、LISA法檢測各組細胞IL-8水平，GraphPad Prism5.0軟件計算半抑制濃度(IC50)。HDAC2活性檢測試劑盒檢測各組細胞HDAC2活性。
　　研究結(jié)果：
　　第一部分
　　青蒿琥酯組BALF細胞總數(shù)顯著低于溶媒組[21.00(2.50)×104/ml比35.50(2.50)×104/ml，P＜0.001]，以中性粒細胞最明顯[6.00(5.12)×104/ml比13.60(5.25)×104/ml，P

7、＜0.001]。青蒿琥酯組BALF IL-8、血清丙二醛、肺組織3-NT水平和總SOD活性均顯著低于溶媒組[分別為(508±55)比(912±68) pg/ml、(38.2±8.8)比(48.7±10.6)μmol/L、(28.5±5.8)比(50.0±9.7) ng/ml和(11.8±1.8)比(18.0±5.3) U/mg蛋白，均P＜0.05]。4組總GPx活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義。青蒿琥酯組Nrf2蛋白表達顯著高于溶媒組(P=0.00

8、8)。
　　第二部分
　　體內(nèi)實驗:1.與正常組相比，煙霧哮喘組小鼠RI、RE顯著增高，Cdyn明顯降低（均P＜0.001）;青蒿琥酯與地塞米松作用相似，顯著降低小鼠對倍增濃度乙酰甲膽堿的氣道反應(yīng)性（均P＜0.001），并改善Cdyn（均P＜0.001）。2.煙霧哮喘組小鼠BALF細胞總數(shù)及各分類計數(shù)均顯著高于正常組（均P＜0.05），尤其中性粒細胞和嗜酸粒細胞顯著（均P＜0.05）;與煙霧哮喘組相比，青蒿琥酯和地塞米松均顯

9、著降低BALF細胞總數(shù)和嗜酸粒細胞數(shù)（均P＜0.05），但是青蒿琥酯可以明顯降低中性粒細胞數(shù)(P＜0.05)，而地塞米松對中性粒細胞數(shù)無明顯作用。3.與正常組相比，煙霧哮喘組BALF中IL-4、IL-8、IL-13和TNF-α水平均顯著升高（均P＜0.001），溶媒對各炎癥因子無明顯作用;與溶媒組相比，青蒿琥酯明顯降低IL-4、IL-8、IL-13和TNF-α水平（分別為P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001，P=0.001）;

10、與煙霧哮喘組相比，地塞米松顯著降低IL-4、IL-8、IL-13水平（分別為P＜0.001，P=0.017，P＜0.001），但對TNF-α無明顯抑制作用(P=0.388)。4.煙霧哮喘組和溶媒組小鼠肺組織切片HE染色與正常組相比有嚴重的炎癥反應(yīng)，青蒿琥酯和地塞米松可以顯著改善肺組織炎癥程度。5.煙霧哮喘組肺組織HDAC2活性明顯低于正常組(P=0.018)，溶媒對HDAC2活性無明顯影響。與溶媒組相比，青蒿琥酯明顯恢復(fù)HDAC2活性(

11、P=0.030)。地塞米松組HDAC2與煙霧哮喘組相比無顯著差異。6.Western印跡結(jié)果示各組肺組織PI3Kγ蛋白表達無明顯差異;與溶媒組相比，青蒿琥酯明顯抑制PI3Kδ蛋白表達(P＜0.001);地塞米松對PI3Kγ和PI3Kδ蛋白表達無明顯作用。煙霧哮喘組Akt1磷酸化水平顯著高于正常組(P＜0.001);與溶媒組相比，青蒿琥酯明顯抑制Akt1磷酸化(P＜0.001);地塞米松對Akt1磷酸化無明顯作用。各組HDAC2表達無明顯

12、差異。煙霧哮喘組與溶媒組HDAC2磷酸化水平無明顯差異，均顯著高于正常組(P＜0.001);與溶媒組相比，青蒿琥酯明顯抑制HDAC2磷酸化(P＜0.001);地塞米松對HDAC2磷酸化無明顯作用。
　　體外實驗:對照組地塞米松IC50為6.31×10-9M;地塞米松組IC50為2.51×10-6M，顯著高于青蒿琥酯地塞米松共同處理組[（3.98×10-7）M，P＜0.001]。CSE處理組HDAC2活性顯著低于對照組(P=0.00

13、2);地塞米松組與CSE處理組HDAC2活性無明顯差異(P=0.409);青蒿琥酯組和青蒿琥酯地塞米松共同處理組HDAC2活性均顯著高于CSE處理組(分別為P=0.001，P=0.009)。
　　研究結(jié)論：
　　1.青蒿琥酯減輕煙草煙霧暴露小鼠肺組織氧化損傷并上調(diào)Nrf2蛋白的表達，其作用可能通過由Nrf2介導(dǎo)的通路實現(xiàn)。
　　2.青蒿琥酯可能通過抑制PI3Kδ/Akt通路改善煙草煙霧暴露哮喘小鼠氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥