丹參酮衍生物DS-201脂質(zhì)體的制備及其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)BKCa通道激活和增強(qiáng)血管舒張作用的研究.pdf

1、目的:丹參酮ⅡA磺酸鈉（DS-201）是傳統(tǒng)活血化瘀中藥丹參的主要有效成分丹參酮ⅡA經(jīng)磺化成鹽后形成的水溶性衍生物，是一種BKCa通道開放劑和血管擴(kuò)張劑，已在臨床上用于冠心病、心絞痛和心肌梗死等缺血性心腦血管疾病的治療，它具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、顯著增加冠脈血流量，減慢心率，增加心肌收縮力等作用。DS-201作為一種水溶性藥物，保證了在水相中的溶解性，但卻限制了透過細(xì)胞膜的能力，從而影響到DS-201對(duì)靶細(xì)胞的胞內(nèi)作用而降

2、低了療效。研究發(fā)現(xiàn)，DS-201的血管舒張作用與血管平滑肌細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa通道）激活相關(guān)，其作用主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮，細(xì)胞內(nèi)給藥比細(xì)胞外給藥產(chǎn)生的作用大100多倍。脂質(zhì)體作為藥物載體根據(jù)投送目的，具有可將水溶性、脂溶性或兩性藥物遞送到組織、細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)等部位的優(yōu)點(diǎn)，以提高藥物治療指數(shù)，降低藥物毒性和減少藥物副作用。本研究以脂質(zhì)體為DS-201的傳遞載體，旨在將DS-201直接導(dǎo)入細(xì)胞，充分發(fā)揮DS-201的BKCa通道激活

3、作用及血管舒張作用，以期提高DS-201的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法技術(shù)的建立將在有效治療藥物的應(yīng)用研究等方面有重要理論指導(dǎo)意義和實(shí)用價(jià)值，特別是在推廣和擴(kuò)大中藥的應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。
　　方法:(1) DS-201脂質(zhì)體的制備及其優(yōu)化篩選:①薄膜超聲分散法制備DS-201脂質(zhì)體。②超速冷凍離心法分離脂質(zhì)體與游離的DS-201。③高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定DS-201的含量。④以泄漏率(LR)為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化篩選出最

4、優(yōu)處方。(2) DS-201脂質(zhì)體的物理特性評(píng)價(jià):①采用透射電鏡(TEM)觀察外觀形態(tài)。②Zeta電位及粒度分析儀測(cè)定脂質(zhì)體Zeta電位及其粒徑分布。③以一個(gè)月前后包封率的變化即泄漏率來衡量DS-201脂質(zhì)體的初步穩(wěn)定性;采用冷凍干燥法制備DS-201脂質(zhì)體的凍干制劑即前體脂質(zhì)體來提高穩(wěn)定性。(3)最優(yōu)處方DS-201脂質(zhì)體生物活性的體外評(píng)價(jià):①制備裝載綠色熒光蛋白(GFP)的DS-201脂質(zhì)體，將其與HEK-293細(xì)胞共培育后進(jìn)行熒光

5、成像實(shí)驗(yàn)。②采用膜片鉗技術(shù)驗(yàn)證DS-201脂質(zhì)體的BKCa通道激活作用。HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染人源血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的BKCa通道。分別比較DS-201原藥組、空白脂質(zhì)體組和DS-201脂質(zhì)體對(duì)BKCa單通道電流和BKCa全細(xì)胞電流的作用。③采用離體微血管張力測(cè)定系統(tǒng)(DMT)驗(yàn)證DS-201脂質(zhì)體的血管舒張作用，分別比較DS-201原藥組、空白脂質(zhì)體組和DS-201脂質(zhì)體組給藥后對(duì)血管收縮劑苯腎上腺素(PE)和前列腺素(PGF

6、2α)引起的血管收縮的舒張效應(yīng)。
　　結(jié)果:(1)采用薄膜超聲分散法制備，經(jīng)均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化篩選出的最優(yōu)脂質(zhì)體配方是:大豆磷脂濃度5mg/ml，大豆磷脂與膽固醇的質(zhì)量比4∶1，探頭超聲時(shí)間25min，DS-201與膽固醇的體積比7∶1。(2)①?gòu)腡EM圖觀察到最優(yōu)處方脂質(zhì)體呈圓球形或類圓形，結(jié)構(gòu)較完整且分布較均一。②最優(yōu)處方脂質(zhì)體的平均粒徑為206.93±4.10nm(n=3)，Zeta電位為-36.79±0.54mV(n=3)。③最

7、優(yōu)處方脂質(zhì)體的凍干制劑一個(gè)月內(nèi)的泄漏率為4.64％。(3)①裝載GFP的DS-201脂質(zhì)體與HEK-293細(xì)胞共培育24h后，在熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞膜周圍呈現(xiàn)綠色熒光。②DS-201脂質(zhì)體組使單通道貼附式膜片下BKCa通道的開放概率從0.013±0.004增加至0.036±0.011(n=10，P＜0.05，Vm=+40mV);使全細(xì)胞膜片下BKCa通道的電流密度從23.2±4.4pA/pF增加至66.0±15.2pA/pF(n=6，

8、P＜0.05，Vm=+40mV)。DS-201原藥組和空白脂質(zhì)體組給藥前后BKCa通道電流的變化無明顯差異。③DS-201脂質(zhì)體對(duì)PE或PGF2α誘導(dǎo)大鼠腸系膜動(dòng)脈血管收縮的抑制百分比約為60％，而原藥對(duì)照DS-201則只產(chǎn)生約為20％的抑制率(n=6，P＜0.05)。
　　結(jié)論:本課題篩選的DS-201脂質(zhì)體能成功地將DS-201導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)VSMCs上BKCa通道的激活及對(duì)PE或PGF2α預(yù)收縮大鼠腸系膜動(dòng)脈血管產(chǎn)生明顯抑